Техника одновременно визуализировать вирус-специфических CD8 + T-клетки и инфицированные вирусом клетки В месте

Путем сочетания гибридизации in situ и тетрамерного окрашивания с помощью метода, известного как ISTH, можно определить относительное количество и пространственные взаимосвязи между иммунными эффекторными клетками, специфичными к вирусным антигенам, и клетками и тканями, инфицированными вирусом. Метод ISTH начинается с заливки свежей ткани, инфицированной SIV, в агар. Ткань нарезают на срезы толщиной 200 micron с помощью вибратома и окрашивают на вирусный антиген.

Специфические CD8+ клетки выявляют с помощью MHC-тетрамеров, меченных FITC. После замораживания окрашенные срезы дополнительно разрезают на секции толщиной 8 µm с использованием криостата, после чего проводят гибридизацию in situ для локализации вирусно-инфицированных клеток. Конфокальная микроскопия используется для получения изображений срезов с двойным окрашиванием и последующей реконструкции исходных толстых секций для выявления взаимосвязи между эффекторными иммунными клетками и клетками-мишенями.

Использование данной процедуры для изучения ранних стадий инфекции SIV оказалось надежным предиктором тяжести последующего заболевания. Здравствуйте, я Чинен Ли из лаборатории Эшли HA на кафедре микробиологии Университета Миннесоты. Я Пэм Скиннер, адъюнкт-профессор кафедры ветеринарных биомедицинских наук Университета Миннесоты.

Сегодня мы продемонстрируем вам процедуру гибридизации in situ, совмещенной с окрашиванием тетрамерами, или сокращенно ISTH. Помимо использования окрашивания тетрамерами in situ в сочетании с гибридизацией in situ, которое мы демонстрируем сегодня, мы также регулярно применяем окрашивание тетрамерами in situ в сочетании с иммуногистохимией для определения локализации, количества и профиля экспрессии белков антигенспецифических CD8+ T-клеток in situ. Помогать нам сегодня с окрашиванием тетрамерами in situ на толстых срезах будут доктор Heon Kim и Terry Matala, а в подготовке тонких срезов и проведении гибридизации in situ нам поможет So. Итак, приступим.

Для начала данной процедуры охладите виброванну Vibram с помощью стерильного PBSH до 2 °C. Установите угол наклона вибролезвия на 27 градусов. По возможности храните свежие ткани в охлажденном состоянии на льду и приступайте к процедуре в течение 24 часов после забора тканей.

Для минимизации деградации при охлаждении вибратом также облегчается процесс взятия свежей ткани: удалите соединительную ткань, разрежьте образец скальпелем на мелкие кусочки, поместите их в лодочку для образцов и залейте 4% низкоплавящим агарозом в PBS, расплавленным при температуре около 40 °C. Убедитесь, что ткань контактирует с дном чашки; если кусочки ткани всплывают, прижмите их вниз, затем закрепите путем охлаждения на льду в течение трех-пяти минут.

В данном примере используется ткань селезенки, однако с помощью скальпеля также можно использовать лимфатические узлы, влагалище, шейку матки, матку или другие свежие ткани. Вырежьте ткань вместе с окружающим агарозом и с помощью пинцета осторожно перенесите фрагмент ткани в агарозе на тканевый блок. Затем зафиксируйте его на блоке Vibram с помощью клея Loctite.

Не перемещайте фрагмент ткани после его размещения на блоке. Оставьте просохнуть примерно на 10 минут на льду. Затем установите блок ткани в вибротом и нарежьте ткань срезами толщиной 200 micrometer, используя очень низкую скорость подачи вперед и относительно большую амплитуду.

С помощью кисти перенесите вырезанные срезы в специализированную камеру для тканей, помещенную в лунку 24-луночного планшета для культивирования тканей, предварительно заполненную 1 мл охлажденного PBSH. Поместите до четырех срезов ткани в каждую камеру. Маркируйте образцы и закрепите крышку планшета резинкой, чтобы приступить к окрашиванию срезов тканей на вирус-специфичные Т-клетки.

Конъюгированные тетрамеры ZI сначала разводят в блокирующем буфере до концентрации 0.5 micrograms per milliliter. Раствор переносят пипеткой в 24-луночный планшет из расчета один milliliter на лунку. Свежеразрезанную ткань переносят в планшет в камеры для тканей и оставляют на качалке на ночь при температуре four degrees Celsius.

Оставляйте одну пустую лунку между камерами с различными образцами тканей, чтобы предотвратить перекрестное загрязнение растворов на последующих этапах. На данном этапе можно добавить антитела, направленные против внеклеточных или поверхностных белков клеток. Для промывки после первичной инкубации подготовьте 24-луночный планшет для культивирования тканей с охлажденным PBSH.

Промойте образцы дважды, перенося камеры с тканями в предварительно заполненный планшет на 20 минут за каждую процедуру; перед переносом обязательно слейте большую часть жидкости из камер. Также следите за тем, чтобы содержимое одного образца не попало в другой при перемещении камер, и контролируйте состояние срезов в камерах, чтобы они не прилипали к стенкам. После фиксации зафиксируйте срезы свежим 4%паральдегидом в PBS в течение двух часов при комнатной температуре.

Промойте срезы дважды холодным раствором PBSH по пять минут каждый раз для усиления сигнала тетрамеров. Инкубируйте срезы с кроличьими антителами anti-fitzy в разведении 1:10 000 в блокирующем буфере от одного до трех дней. На этом этапе можно добавить антитела к внутриклеточным эпитопам.

Убедитесь, что перед добавлением антитела клетки пермеабилизированы, а неспецифические сайты заблокированы. Также может потребоваться восстановление антигена после второй длительной инкубации, предназначенной для усиления сигнала. Промойте срезы в PBSH трижды; каждая промывка должна длиться от 20 минут до нескольких часов.

Проведите финальную инкубацию с соответствующими флуоресцентно меченными антителами. Например, можно использовать козьи антитела против кроличьих SI three для связывания кроличьих антител anti fitzy, чтобы клетки, окрашенные тетрамером, флуоресцировали красным. Если для контрастного окрашивания интересующих белков, таких как CD eight, для визуализации киллеров-T-клеток использовались мышиные антитела, можно использовать козьи антитела anti-US Alexa 488 для связывания с мышиными антителами, чтобы клетки, окрашенные антителами, флуоресцировали зеленым; разведения каждого антитела должны быть определены эмпирически.

Инкубируйте от одного до трех дней, обернув планшеты алюминиевой фольгой для защиты срезов от света во время и после инкубации, так как свет вызывает затухание флуоресценции. В завершение повторно зафиксируйте срезы, чтобы надежно закрепить тетрамеры и антитела. Промойте и закрепите на предметном стекле с использованием глицерин-желатиновой среды, содержащей 4 mg/mL N-пропилгаллата, для хранения при -20 °C до момента подготовки тонких срезов для гибридизации in situ.

Срезы с окрашиванием тетрамерами in situ теперь можно анализировать с помощью конфокального микроскопа для определения локализации, количества и паттерна экспрессии белков антигенспецифических CD8+ T-клеток. На представленном изображении срезы ткани селезенки макаки-резуса, инфицированной SIV, окрашены Gag-тетрамерами для маркировки SIV-специфических CD8+ T-клеток, а также антителами к CD20 и CD3. Поскольку контрастное окрашивание антителами будет утрачено на следующем этапе, важно проанализировать результаты окрашивания тетрамерами in situ перед дальнейшим продолжением работы.

Начните процедуру получения тонких срезов с нагревания срезов толщиной 200 мкм при 70 °C в течение пяти минут на термоблоке, чтобы отделить толстые срезы от предметного стекла. После отделения срезов заключайте их в OCT на сухом льду, предварительно заполнив дно пластиковой формы OCT. Затем поместите ткань поверх OCT и залейте ее OCT.

С помощью криостата приготовьте срезы толщиной 8 мкм из блоков, залитых OCT, и нанесите их на силилизированные стекла. Затем стекла можно хранить при температуре -80 °C в герметичном контейнере для последующей гибридизации in situ. Стандартный метод гибридизации in situ используется для обнаружения инфицированных вирусом клеток с помощью вирус-специфических рибозондов, меченных S 35.

Процедура также включает покрытие срезов ядерной трековой эмульсией и закрепление предметных стекол. В совместимой с флуоресценцией среде Paramount конфокальные изображения регистрируют с помощью конфокального микроскопа BioRad MRC 1000, оснащенного устройством эпи-отражения синего света. Окрашивание тетрамерами in situ визуализируют с использованием фильтра EPI one 605 для красного флуорохрома тетрамера и EPI 2 522 DF 32 для зеленого флуорохрома CD8 при гибридизации in situ.

Используйте режим отраженного света EPI (два синих фильтра) для визуализации зерен серебра, образовавшихся в результате сигнала гибридизации in situ на проявленных радиоавтографах. Для начала сбора данных снимайте изображения каждого среза слева направо и сверху вниз, обеспечивая перекрытие каждого изображения с соседними примерно на 20%. Чтобы избежать пропусков в реконструированном монтажном изображении, присваивайте каждому снимку имя в соответствии с его строкой и столбцом в файле Excel.

После завершения сбора данных с предметных стекол используйте программное обеспечение confocal assistant для проецирования серийных Z-изображений каждого канала в одно изображение с помощью процедуры Photoshop 7 (доступно по запросу у авторов), затем автоматически объедините спроецированные изображения трех каналов в одно RGB-изображение. Затем сшейте объединенные изображения по слоям для создания монтажного изображения всего среза. С помощью программ metamorph или Photoshop соотнесите отдельные зерна серебра и окрашивание тетрамером с соответствующими клетками на монтажном изображении.

Присвойте XY-координаты центров или OID для клеток, положительных по вирусной РНК, и клеток, положительных по тетрамеру. Экспортируйте данные OID в файлы Excel в виде числовых значений для каждой клетки и используйте данные, собранные в файлах Excel, для определения соотношения иммунных эффекторных клеток (E-клеток) к вирусным мишеням (T-клеткам), исходя из общего количества тетрамер-положительных и РНК-положительных клеток в срезе, чтобы зафиксировать пространственные взаимосвязи между тетрамер-положительными и РНК-положительными клетками. Скопируйте и вставьте соответствующие графики из файлов Excel в документ Photoshop в программе Photoshop.

Уменьшите непрозрачность слоя, чтобы совместить и масштабировать сетки до полного совпадения цветов, выделите их, а затем скопируйте и вставьте в новый слой. После определения положения синих RNA-положительных клеток удалите слой, использовавшийся для совмещения сеток; тогда на объединенном изображении станут видны положения тетрамер-положительных и вирус-RNA-положительных клеток. Используя представленный здесь метод ISTH, мы можем отслеживать иммунный ответ на инфекцию SIV после внутривагинального введения через данный портал проникновения, а также в лимфоидных тканях, в которые распространяется инфекция.

На 10-й день после инфицирования в этих участках тканей наблюдается большое количество инфицированных клеток, однако спустя три дня все еще присутствуют окрашенные зеленым цветом CD8+ клетки, но отсутствуют окрашенные красным цветом SIV-специфические тетрамер-положительные клетки. Таким образом, иммунный ответ наступает слишком поздно, чтобы элиминировать инфекцию.

Однако через три недели после заражения отчетливо видно снижение количества инфицированных клеток, особенно в месте проникновения вируса. Мы использовали метод ISTH, чтобы показать, что степень этого снижения коррелировала с пространственной близостью и относительным количеством тетрамер-положительных иммунных эффекторных клеток по отношению к N-S-I-V-R-N-A положительным клеткам-мишеням; мы называем это соотношением E к T in vivo.

С помощью данного метода пространственные взаимосвязи легко визуализируются: в этом инфицированном лимфатическом узле эффекторные клетки окрашены в красный цвет, а вирусные мишени — в синий. Многие эффекторные клетки и клетки-мишени находятся в непосредственной близости друг от друга; наблюдаются области, где множество эффекторных клеток окружают одну S-I-V-R-N-A-положительную клетку, в то время как в других областях S-I-V-R-N-A-положительная клетка находится изолированно. Отношение E:T рассчитывается простым путем: координаты клеток определяются и заносятся в файл Excel в виде количества клеток каждого типа.

Наилучший контроль вирусной инфекции коррелирует с значительным избытком красных эффекторов по отношению к зеленым мишеням в соотношении 43 к одному. В данном случае в шейке матки и влагалище, где началась инфекция, соотношения E:T были ниже, чем в лимфатических узлах. Положительная корреляция между высокими соотношениями E:T и снижением вирусной нагрузки с пикового уровня указывает на то, что более интенсивный иммунный ответ в месте проникновения вируса приводит к лучшему контролю инфекции.

Мы только что продемонстрировали вам способ одновременного обнаружения специфических CD8+ Т-клеток и инфицированных вирусом клеток in situ. Данный метод позволяет одновременно визуализировать антигенспецифические Т-клетки и инфицированные вирусом клетки в тканях. Эта методика может быть применена для оценки вакцин на основе CD8+ Т-клеток, а также для изучения взаимодействия патогена и хозяина при других типах инфекций при выполнении данной процедуры.

Важно следить за тем, чтобы все реагенты оставались свободными от РНКаз перед проведением гибридизации in situ. На этом все. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.