Сотовая Инкапсуляция в 3D гидрогелей для тканевой инженерии

Поэтапный процесс инкапсуляции клеток начинается с подготовки и стерилизации форм для гидрогеля и других материалов, после чего следует изоляция клеток в отдельные популяции в пробирки для каждого набора гелей. Затем, в присутствии клеток, проводится полимеризация, после чего следует период инкубации in vitro или in vivo. Последующий анализ поведения клеток может включать тесты на жизнеспособность, морфологию, пролиферацию и дифференцировку.

Здравствуйте, я Амидио Кахан из лаборатории доктора Джейсона Бёрдика с кафедры биоинженерии Пенсильванского университета. Сегодня мы продемонстрируем процедуру инкапсуляции клеток в 3D-гидрогели для тканевой инженерии. Мы используем этот метод для изучения влияния состава и структуры гидрогеля на поведение инкапсулированных клеток.

Итак, приступим. Для начала данной процедуры приготовьте 0,5% вес/об раствор фотоинициатора Irgacure 2959 в PBS. Перемешайте и инкубируйте в течение двух-трех дней в темноте при 37 °C.

Когда раствор будет готов, простерилизуйте его с помощью шприцевого фильтра и храните при комнатной температуре. Затем, используя программу для работы с электронными таблицами, такую как Microsoft Excel, рассчитайте необходимое количество полимера и сшивающего агента, как показано в примере. Здесь представлена гиалуроновая кислота, функционализированная акрилатными реактивными группами.

Также рассчитайте количество пентапептида, содержащего функциональный адгезивный домен с аминокислотами цистеином, аргинином, глицином и аспартатом. Цистеин необходим для прикрепления к полимеру. После определения требуемого количества полимерного сшивающего агента и пептида, отвесьте их и поместите каждый в отдельную пробирку Эппендорфа.

Соответственно скорректируйте расчетную таблицу. Для определения фактической массы полученного полимера переходите к разделу «Приготовление форм для геля». С помощью лезвия бритвы отсеките наконечники индивидуально упакованных стерильных.

Одноразовые шприцы объемом 1 мл. Убедитесь, что срез выполнен ровно, чтобы формы можно было использовать для переноса фотопаттерна на гели. В завершение простерилизуйте формы из шприцев, трубки EOR с открытыми колпачками и другие необходимые материалы, поместив их под бактерицидную лампу в биологическом боксе на 30 минут.

После завершения стерилизации приступите к подготовке клеток, предварительно простерилизовав экспериментальное оборудование. Работая в вытяжном шкафу, добавьте стерильный TEA к полимеру, используемому для сшивания микального типа, и стерильный PBS к полимеру, используемому для сшивания свободными радикалами. Добавьте соответствующий буфер в пробирки с подвешенными функциональными группами и перемешайте на вортексе.

Для того чтобы растворимая подвесная часть связалась с алкилированной гиалуроновой кислотой посредством тиольной группы INE-фрагмента пептида для прикрепления подвесной части к полимеру, добавьте её в раствор полимера и герметично закройте параметрами. Кратко: перемешайте на вортексе и инкубируйте при 37 °C с перемешиванием. Пока происходит прикрепление подвесной части, подготовьте клетки для инкапсуляции (например, мезенхимальные стволовые клетки человека или HMCs), промыв их PBS.

Затем инкубируйте с трипсином в течение одной минуты при комнатной температуре, удалите трипсин и инкубируйте еще пять минут при 37 °C. После этого добавьте ростовую среду для HMSC, чтобы нейтрализовать трипсин и высвободить клетки с поверхности планшета. Подсчитайте количество клеток с помощью гемоцитометра.

Разделите подсчитанные клетки на порции, содержащие необходимое количество для каждого набора гелей. Для набора из трех гелей по 50 µL при плотности 10 млн клеток на мл перенесите 1,5 млн клеток в отдельную коническую пробирку. Не подготавливайте более четырех гелей в одном наборе из-за временных ограничений по подготовке.

Затем центрифугируйте клетки при 500 RCF в течение шести минут. Пока клетки осаждаются, при комнатной температуре приготовьте смесь для полимеризации для кросс-линкинга mical edition. Добавьте буфер к кросс-линкеру для достижения необходимой концентрации.

Для фотоинициированного свободнорадикального сшивания добавьте ранее приготовленный раствор I 2 9 5 9 к раствору полимера. Добавьте его в объеме 10% от общего объема формируемого геля, чтобы конечная концентрация инициатора составила 0,05% по массе. Теперь клетки и полимеризационная смесь готовы к инкапсуляции в гидрогель.

Начните с аспирации супернатанта из центрифугированных клеток. Дождитесь оседания жидкости после первой аспирации и проведите повторную аспирацию, чтобы удалить максимально возможный объем среды, не нарушая целостность клеточного осадка. Ресуспендируйте клеточный осадок с помощью полимерного раствора, чтобы предотвратить образование пузырьков воздуха.

Медленно прокачайте раствор через пипетку вверх-вниз около 10 раз, чего должно быть достаточно для равномерного распределения клеток. Для реакции присоединения микального типа используйте наконечник пипетки с широким отверстием, чтобы добавить соответствующий объем раствора сшивающего агента в полимерную ячейку. Перемешайте. Установите на пипетке желаемый объем для отдельного геля.

Перемешайте раствор, несколько раз всасывая и вытесняя его пипеткой для гомогенизации, и залейте в формы для наконечников шприцев. Выполняйте этот этап быстро, чтобы обеспечить равномерное распределение клеток, и выдержите в культуральном боксе от 10 до 30 минут для сшивания. Для инициации радикального сшивания с помощью света.

Расположите соответствующий объем смеси в формах для наконечников шприцев. Подвергните шприцы воздействию УФ-излучения с длиной волны 365 нанометров в течение 10 минут для радикальной сшивки. Для полимеров, функционализированных ACRL, обычно используется УФ-излучение мощностью 4 милливатта на квадратный сантиметр.

Выполняйте этот этап быстро, чтобы минимизировать оседание клеток перед воздействием УФ-излучения. После сшивания погрузите гели в лунки планшета для культивирования тканей, содержащие среду для инкубации и анализа. Сшивание гидрогеля также может быть выполнено последовательно.

Сначала добавьте функционализированный краситель метилированный румин до конечной концентрации 20 nanomolar в геле. Краситель помогает визуализировать структуру, так как он преимущественно встраивается в радикально сшитые области геля. Затем начните реакцию полимеризации типа mic, обеспечивающую получение определенной доли теоретических сшивок для последующих этапов.

Для сшивания путем свободнорадикальной полимеризации необходимо использовать маску, созданную в такой программе, как Adobe Photoshop или Illustrator, и распечатанную непосредственно на прозрачных пленках. Размеры маски должны соответствовать диаметру верхней части круглого шприца. С помощью стерильного пинцета наложите стерильную маску непосредственно на поверхность геля и подвергните воздействию света для сшивания геля.

Далее представлены HMC в гидрогелях на основе HA через один час после инкапсуляции. Поскольку синтезированные гидрогели обычно прозрачны, морфологию клеток можно визуализировать с помощью световой микроскопии. Жизнеспособность тех же клеток была визуализирована через 24 часа после инкапсуляции с использованием набора для флуоресцентного окрашивания живых и мертвых клеток.

Для детекции живых клеток мы использовали calcium M, а для погибших клеток — atherium homodimer; при этом жизнеспособность составила более 95%. Также мы применили тест Alamar Blue для определения уровня пролиферации клеток, который измеряли по интенсивности метаболизма реагента, приводящего к изменению цвета. Окрашивание клеток H HMCs проводили через семь дней после инкапсуляции в биодеградируемом адгезивном гидрогеле на основе HA с использованием стандартных процедур фиксации и пермеабилизации.

Клеточный актин визуализируют с помощью флуоресцеиново-меченого фаллоидина, а ядра окрашивают DPI. Для визуализации фокальных адгезий внутри матрицы гидрогеля используют иммуноокрашивание на куллин. Гистологическое окрашивание проводят после дегидратации, заливки в парафин и срезания радикально полимеризованных гидрогелей HA с инкапсулированными HMSC согласно стандартным протоколам.

После одной недели культивирования окрашивание проводили гематоксилином для маркировки ядер и анилиновым синим для окрашивания соединительной ткани и гликозаминогликанов. ПЦР в реальном времени используется для количественного определения дифференцировки инкапсулированных стволовых клеток. После вычитания фонового сигнала уровень экспрессии интересующего гена определяется по номеру цикла, при котором достигается пороговое значение флуоресценции, по сравнению с пассивным референсным сигналом — конститутивно активным геном «домашнего хозяйства». Таким образом, мы продемонстрировали способ инкапсуляции клеток в 3D-гидрогели и метод изучения поведения клеток в гелях.

При использовании этих процедур важно обеспечить полную стерильность материалов, либо путем длительного хранения стерильных буферных растворов и реагентов, либо путем стерилизации с помощью бактерицидной УФ-лампы. На этом все. Спасибо за внимание и удачи в ваших экспериментах.