Микрообъеме концентрации белка Определение использованием NanoDrop 2000c Спектрофотометр
4 ноября 2009 г.
7.2K просмотров
Микрообъеме образцы количественно с помощью спектрофотометра система, которая использует природный поверхностного натяжения, чтобы сохранить образцы без использования кювет или капилляров. Динамический диапазон белков концентрации и скорость, с которой они могут быть измерены значительно повышаются с этим методом.
Обзор
Спектрофотометр NanoDrop 2000 C использует инновационную технологию для измерения микрообъемов образцов белков и нуклеиновых кислот без применения традиционных кювет. Этот метод увеличивает скорость измерения и расширяет динамический диапазон, что позволяет эффективно определять концентрацию белка.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Биохимия
- Аналитическая химия
- Анализ белков
Теоретическая база
- В технологии NanoDrop используются волоконная оптика и поверхностное натяжение для удержания образца.
- Она позволяет проводить прямое измерение малых объемов образцов (1-2 µL).
- Отказ от использования кювет снижает требования к количеству образца и сокращает время на очистку.
- Система позволяет измерять высокие концентрации без разбавления.
Цель исследования
- Продемонстрировать процедуру определения концентрации белка с помощью NanoDrop 2000 C.
- Осветить преимущества микрообъемной спектрофотометрии.
- Предоставить рекомендации по эффективному использованию прибора.
Используемые методы
- Пипетирование образца непосредственно на оптический пьедестал.
- Использование холостой пробы для калибровки с соответствующим буфером.
- Измерение абсорбции при 280 nm для определения концентрации белка.
- Использование колориметрических методов анализа, таких как BCA, для нехарактеризованных белков.
Основные результаты
- NanoDrop 2000 C обеспечивает быстрое и точное измерение концентрации белка.
- Поверхностное натяжение эффективно удерживает микрообъемы образцов для анализа.
- Регулировка длины оптического пути в режиме реального времени повышает точность измерений.
- Между измерениями требуется минимальная очистка поверхности.
Выводы
- NanoDrop 2000 C является ценным инструментом для анализа белков в исследовательских целях.
- Его конструкция упрощает процесс измерения и сокращает расход образцов.
- Колориметрические методы расширяют возможности его применения для различных образцов белков.
Часто задаваемые вопросы
В чем основное преимущество использования NanoDrop 2000 C?
Основным преимуществом является возможность измерения микрообъемов образцов без использования кювет, что позволяет быстрее и эффективнее определять концентрацию белка.
Какой объем образца необходим для измерения?
Для измерения требуется всего 1-2 µL образца.
Может ли NanoDrop 2000 C измерять образцы с высокой концентрацией?
Да, он может измерять высокие концентрации без необходимости разведения благодаря регулируемой длине оптического пути.
Какие типы образцов могут быть проанализированы?
Оно позволяет анализировать белки и нуклеиновые кислоты, в частности те, что содержат специфические остатки, поглощающие при 280 nm.
Какой метод очистки рекомендуется для оптических постаментов?
Для очистки оптических поверхностей между измерениями рекомендуется использовать сухую лабораторную салфетку.
Существуют ли растворители, которые нельзя использовать с NanoDrop?
Да, растворы плавиковой кислоты и реагенты, содержащие поверхностно-активные вещества, использовать нельзя, так как они могут повлиять на измерительные поверхности.
Практическая значимость для промышленности
Количественное определение белков в микрообъемах решает проблему ограниченного количества доступного образца на ранних этапах поиска, обеспечивая точную валидацию мишени при минимальном расходе материала. Прибор NanoDrop 2000c повышает достоверность прогнозов, предоставляя быстрые и воспроизводимые данные о концентрации без необходимости разведения, что способствует принятию решений о целесообразности дальнейшего исследования при идентификации ведущих соединений. Регулировка длины оптического пути в режиме реального времени и широкий динамический диапазон улучшают стандартизацию анализа в рабочих процессах поиска новых лекарственных средств.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проводить анализ очищенных образцов белка с помощью абсорбции при 280 нм для быстрой оценки экспрессии и чистоты.
- Практическая ценность: снижает расход образца до 1-2 µL, сохраняя ценный материал для последующих анализов.
- Прогностическая ценность: способствует функциональной валидации мишеней, обеспечивая точные данные о концентрации для исследований активности и связывания.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: облегчает подготовку стандартизированных количеств белка для биохимических и клеточных анализов посредством точного количественного определения.
- Практическая ценность: исключает использование кювет и этапы разведения, что ускоряет подготовку к анализу и повышает воспроизводимость.
- Масштабируемость: обеспечивает готовность к высокопроизводительному анализу за счет быстрого измерения и простого протокола очистки поверхности между образцами.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная преемственность: способствует согласованности биомаркеров, обеспечивая количественное определение белковых стандартов и образцов в анализах на основе метода BCA.
- Релевантность доклинических моделей: обеспечивает точность дозирования в функциональных исследованиях за счет предоставления надежных данных о концентрации лизатов и экстрактов.
- Оптимизация рисков при разработке: снижает неопределенность механизмов в исследованиях по взаимодействию с мишенью благодаря точной нормализации белка.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
NanoDrop 2000c вписывается в континуум процесса разработки — от ранней валидации мишени и идентификации ведущих соединений до доклинической оценки, обеспечивая стабильный количественный анализ белков на всех этапах.
- Биология открытий: способствует проверке гипотез, обеспечивая точную нормализацию образцов белков в исследованиях путей и взаимодействий.
- Скрининг: обеспечивает воспроизводимый ввод белков, готовых к анализу, для ферментативного, связывающего и функционального скрининга.
- Аналитика: предоставляет количественные данные при A280 и колориметрические показатели, позволяющие проводить сравнение между различными условиями и образцами.
- Трансляционные исследования: связывают фундаментальные открытия с доклинической работой посредством надежного количественного определения в BCA-анализах для построения стандартных кривых и анализа образцов.
- Корпоративное повторное использование: функционирует как общая многократно используемая платформа для количественного определения белков в рамках нескольких проектов и групп.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает достоверность прогнозов при валидации мишеней за счет снижения вариативности количественного определения вводимого белка.
- Операционная ценность: улучшает стандартизацию и воспроизводимость благодаря автоматической регулировке длины оптического пути и минимизации манипуляций с образцами.
- Стратегическая ценность: повышает эффективность использования капитала за счет минимизации потерь образцов и сокращения сроков проведения измерений.
- Влияние на портфель: позволяет проводить приоритезацию с учетом рисков благодаря надежным данным о концентрации, необходимым для принятия решений о продолжении или прекращении работы (go/no-go) на этапе оптимизации соединений-лидеров.
Особенности реализации
- Требуется базовый лабораторный навык работы с пипетками и образцами для методов микрообъема.
- Необходим доступ к спектрофотометру NanoDrop 2000c и совместимым лабораторным салфеткам для очистки поверхностей.
- Требуется стандартизация процедур постановки холостой пробы и подбора буфера между членами команды для получения точных результатов.
- Необходимо учитывать особенности подготовки вязких образцов или образцов, содержащих поверхностно-активные вещества, которые могут повлиять на формирование колонки жидкости за счет поверхностного натяжения.
- Существуют практические ограничения, такие как несовместимость с плавиковой кислотой и реагентами с высоким содержанием ПАВ, которые со временем могут привести к деградации оптических поверхностей.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Почему измерение абсорбции при 280 нм важно для валидации мишени?
Оптическая плотность при 280 нм (A280) позволяет проводить быстрое безметочного количественное определение очищенных белков, содержащих остатки триптофана, тирозина или цистеина, что является критически важным для оценки уровней экспрессии и чистоты на ранних этапах рабочих процессов валидации мишеней.
Какое место занимает микрообъемный пробоотбор в процессе поиска и идентификации белков?
Микрообъемный отбор проб с использованием 1-2 µL образца позволяет сберечь ограниченное количество материала из систем экспрессии или результатов очистки, обеспечивая количественное определение без ущерба для материала, необходимого для последующих функциональных или структурных анализов.
Что позволяет регулировка длины оптического пути в реальном времени при количественном определении белков?
Регулировка длины оптического пути в режиме реального времени позволяет NanoDrop 2000c измерять образцы белков с высокой концентрацией без разбавления, что расширяет динамический диапазон и обеспечивает точность показаний для различных типов образцов.
Почему требования к репликации важны для кросс-функционального взаимодействия?
Требования к репликации обеспечивают получение согласованных и воспроизводимых данных о концентрации белка разными пользователями и в разных лабораториях, что позволяет надежно сравнивать результаты при валидации мишеней и разработке методов анализа.
Какой статистический анализ необходим перед проведением количественного определения методом BCA-анализа?
Для количественного определения методом BCA-анализа необходимо построить калибровочную кривую по стандартным образцам, чтобы обеспечить точную интерполяцию концентраций неизвестных образцов, что является обязательным условием для достоверного измерения содержания белка в лизатах или экстрактах.
