Инженерно Cell-проницаемой белка

В последние 15 лет манипулирование клеточными функциями осуществлялось с помощью классических подходов, таких как трансфекция ДНК или вирусная трансдукция. Однако развился и другой метод. Трансдукция белков позволяет доставлять биологически активные белки непосредственно в клетки млекопитающих с использованием небольших пептидов, слитых с целевым белком, что способствует его поглощению клетками.

Поскольку ДНК не используется, исключается риск возникновения агентного генеза. В отличие от вышеупомянутых классических методов, трансдукция белков позволяет осуществлять доставку белков титруемым способом.

Кроме того, можно модулировать небольшие популяции клеток, а также неделящиеся клетки, такие как постмитотические нейроны. Для эффективной экспрессии рекомбинантного белка мы рекомендуем использовать векторную систему Paciz. Она представляет собой модульную векторную систему, состоящую из N-терминального и C-терминального вариантов.

Оба вектора позволяют легко встроить интересующий вас ген для последующей очистки. В состав векторов входят гистидиновый тег, а также домен трансдукции белков. В нашем случае используется домен ВИЧ, способствующий поглощению белка клетками для его внутриклеточного распределения.

Сигнал ядерной локализации дополняет вектор; в целях контроля возможна простая делеция слитных тегов. Кроме того, расположение этих тегов может оказывать существенное влияние на свойства слитных белков. Влияние на выход и чистоту, а также на растворимость и биологическую функцию невозможно предсказать.

Здравствуйте, меня зовут Бернард Мус, я работаю в группе инженерии стволовых клеток в Институте реконструктивной нейробиологии в Бонне, Германия. Здравствуйте, меня зовут Кристоф П., я также являюсь сотрудником лаборатории Хувера. Наша рабочая группа активно использует метод трансдукции белков для прямой доставки биологически активных белков в различные клетки млекопитающих, и сегодня мы хотим ознакомить вас с процессом экспрессии и очистки белков в клетках e coli и из них.

Затем мы продемонстрируем вам, как применять постоянно экспрессируемый слитый белок в клеточной культуре, чтобы проиллюстрировать весь процесс: экспрессию, очистку и применение. Мы используем сайт-специфическую рекомбинацию Cre для генетической модификации стволовых клеток мыши. Хорошо. Итак, приступим.

Для инокуляции ночной культуры мы используем уже трансформированные бактерии, хранящиеся в глицериновой стоке при температуре минус 80 °C. Эти бактерии уже содержат вектор, кодирующий рекомбинацию. С помощью наконечника дозатора мы набираем небольшое количество бактерий и переносим их в стакан с ночной культурой.

Ночная культура представляет собой среду LB, дополненную глюкозой до конечной концентрации 0.5% и 50 µg карбонизированного инсулина на мл. Затем стакан помещают в инкубатор при температуре 37 °C для экспрессии сайт-специфичной рекомбиназы Cre. Для проведения экспрессии в большом масштабе мы используем предварительно нагретую среду TB.

Для ускорения экспрессии мы рекомендуем использовать среду TB, нагретую до 37 °C, что соответствует температуре при экспрессии рекомбинантного белка. Далее в среду TB добавляют глюкозу до конечной концентрации 0,5%. Глюкоза предотвращает повышенную базальную экспрессию слитого белка во время роста экспрессионной культуры до начала индукции. Наконец, в экспрессионную культуру добавляют ампициллин до конечной концентрации 100 µg/ml, чтобы обеспечить чистоту культуры, содержащей только бактерии, которые по-прежнему несут плазмиду, кодирующую целевой белок.

Теперь можно взять ночную культуру и инокулировать культуру для экспрессии в соотношении 1:50. Затем стаканы переносят в инкубатор, работающий при температуре 37 °C. В течение процесса экспрессии следует регулярно отбирать пробы для измерения оптической плотности.

Как только культура достигнет оптической плотности 1,5, бактерии индуцируют с конечной концентрацией 0,5 мМ IPTG. Через один час после индукции культуру экспрессии переносят в пробирки и затем собирают путем центрифугирования. Для этой цели мы используем ротор SLA 3000.

Центрифугирование проводят при скорости 5,000 об/мин в течение 10 минут при температуре 4 °C. Затем супернатант удаляют, а осадок бактерий можно хранить неограниченно долго при температуре -20 °C. Замороженные осадки ресуспендируют в буфере Lysis, используя объем, соответствующий одному литру экспрессионной культуры.

Мы используем 10 ml буфера Lizza и выдерживаем примерно 15 минут до достижения гомогенности раствора. Затем на каждый ml суспензии добавляют один миллиграмм лизоцима. Раствор перемешивают в течение 20 минут, чтобы фермент разрушил бактериальные клетки.

Затем добавляют Бензонзаза в разведении 1:1000 еще на 15 минут, что приведет к расщеплению ДНК и получению раствора с низкой вязкостью. В завершение используют ультразвуковой гомогенизатор для обеспечения лизиса клеток. После завершения процедуры программа работает в течение полутора минут при мощности 45%.

Не забудьте отобрать пробу на каждом этапе: сырого лизата или для анализа очистки с помощью SDS-PAGE. Теперь очень важно добавить 1 мл ледяного буфера TSB на 1 мл суспензии, так как белок может выпадать в осадок в глицериновом стоке. Если вы пропускаете этот шаг, раствор следует быстро перемешать; теперь сырой лизат готов к центрифугированию.

Для этой цели мы используем ротор SS 34. Центрифугирование проводят при 17 000 об/мин в течение 30 минут при температуре 4 °C. По завершении центрифугирования супернатант осторожно переносят в новые пробирки Falcon объемом 50 мл.

Теперь добавьте суспензию никеля анти-A к супернатанту. Анти-A является важнейшим реагентом для правильной очистки гистидин-слитых белков. Гистидин образует комплекс с ионами никеля, что обеспечивает аффинную очистку; теперь осторожно встряхивайте пробирки Паркинга в течение 60 минут при 40 °C.

Через один час можно нанести суспензию на колонки объемом 20 ML и дать раствору пройти через них под действием силы тяжести. При крупномасштабном производстве допустимо разделить суспензию между несколькими колонками. Затем колонку дважды промывают буфером, содержащим 15 millimolar innersole.

Количество добавляемого буфера зависит от объема смолы. Два мл никель-NTA соответствуют одному мл смолы при промывке. После промывки мы добавляем в колонку пять объемов смолы промывочного буфера, после чего можно приступать к элюции белка.

Следовательно, мы используем элюирующий буфер с концентрацией иммуно 250 millimolar. Обратите внимание, как цвет смолы меняется в сторону зеленого. Из-за высоких концентраций белка CRE фракция OID иногда становится мутной.

Чтобы предотвратить это, перемешайте раствор и добавьте дополнительный лизирующий буфер; теперь все фракции объединяются и затем переносятся в пробирку для лизиса. Лизис удалит оле; первый этап диализа проводится с использованием буфера с высокой концентрацией соли. Через один час буфер с высокой концентрацией соли заменяют, и процедуру диализа продолжают в течение ночи.

На следующий день диализную трубку извлекают из буфера с высокой концентрацией соли и переносят в глицериновый буфер. Через три-пять часов глицериновый буфер заменяют и снова проводят диализ в течение ночи. Лизис в глицериновом буфере позволит получить стоковый раствор с концентрацией, как минимум, в три раза выше исходной.

Теперь исходный раствор можно хранить при температуре -20 °C в течение нескольких лет без потери активности. Для контроля качества вы можете нанести собранные образцы для SDS-PAGE на гель и затем окрасить его. В случае с белком слияния Cree он обнаруживается в виде выраженной полосы во фракции OID. Чтобы использовать подходящую концентрацию рекомбинантного белка Cree, следует определить его концентрацию с помощью метода Redford.

Способ введения белков для постоянной экспрессии в клетки млекопитающих. Прежде всего, подготовьте целевые клетки для достижения максимальной эффективности трансдукции белков. Если ваши целевые клетки растут в виде компактных колоний, посейте клетки монослоем с такой плотностью, чтобы на следующий день слой клеток достиг 80–90% конфлюэнтности.

Диссоциируйте клетки и подготовьте их в виде суспензии из отдельных клеток за пять часов до начала работы. Важно создать суспензию из отдельных клеток перед трансдукцией белков, так как в противном случае трансдукции подвергнутся только поверхностные клетки колонии. Аспирируйте среду и коротко обработайте поверхностные клетки PPS перед началом терапии.

Удалите остатки среды, содержащей сыворотку. После аспирации поверхностного слоя PPS осторожно промойте клетки и оставьте их инкубироваться на три-пять минут. Теперь проверьте под микроскопом, все ли колонии распались на одиночные клетки.

По вышеупомянутым причинам этот этап является критически важным для трансдукции белков в клетки дрожжей. Перенесите отделившиеся клетки в пробирку. Поместите пробирку в штатив, центрифугируйте для осаждения клеток, аспирируйте супернатант и ресуспендируйте клетки.

Разведите клетки в среде для роста до достижения подходящего количества клеток. Это, конечно, зависит от размера культуры тканей. Инкубируйте клетки в чашке еще в течение пяти часов.

Это обеспечит клеткам достаточно времени для прикрепления к дну и роста в адгезивном состоянии. Запас линий клеток третьего пассажа можно хранить при температуре -20 °C более двух лет. При работе с рекомбинантными клетками, экспрессирующими постоянные слитые белки, крайне удобно иметь такой стоковый раствор, который можно использовать по мере необходимости.

Пока клетки прикрепляются к планшету, можно подготовить среду для трансдукции, просто разбавив соответствующий объем стокового раствора белка Clare в подходящей среде. Поскольку стоковый раствор Clare не является стерильным, среду для трансдукции необходимо подвергнуть стериلعющей фильтрации перед использованием. Мы рекомендуем использовать шприц, который можно прикрепить к фильтру для связывания белков.

Финальная концентрация creek зависит от типа клеток или добавок в среду. Например, сыворотка оказывает сильное негативное влияние на эффективность трансдукции. Это можно преодолеть, используя безсывороточную среду или увеличив концентрацию creek.

Мы определили оптимальные условия, обеспечивающие максимальную эффективность рекомбинации. Концентрацию гидрата следует варьировать в диапазоне от 0.5 до 10 µM. Рекомендуется протестировать различные интервалы инкубации от 6 до 18 часов.

После пяти часов инкубации извлеките целевые клетки и аспирируйте кросс-среду. Затем замените её средой для трансдукции белком и поместите клетки обратно в инкубатор для инкубации в течение ночи. Кратковременно промойте клетки D раствором PBS и замените среду для трансдукции белком на обычную среду для ES-клеток.

Через 48 часов после инкубации клеток экспрессию трансгена Cre можно обнаружить с помощью X-gal. Окрашивание клеток с положительным β-галактозидным фенотипом свидетельствует об успешном генетическом модифицировании посредством сайт-специфической рекомбинации Cre-репортера.

Клетки содержат конструкцию Lae, использующую CRE после премедианной рекомбинации. Стоп-последовательность, фланкированная сайтами LoxP, вырезается, и активируется репортерный ген luxe под управлением промотора team. Для оценки эффективности рекомбинации в предварительно обработанных репортерных клетках air необходимо провести фиксацию клеток.

Откачайте среду, дважды промойте клетки раствором PBS, залейте клетки 4% PFA и инкубируйте в течение 10 минут при комнатной температуре. После этого снова промойте клетки трижды раствором PBS. После аспирации PBS после последнего этапа промывки добавьте в лунки раствор Xal Stain, затем инкубируйте клетки в течение ночи при 37 °C в инкубаторе.

На следующий день активность Beal можно отслеживать по синим клеткам. Эффективность рекомбинации определяется количеством синих колоний. При оптимальных условиях должна быть достигнута эффективность рекомбинации более 90%. Итак, сегодня мы показали вам, как экспрессировать и очищать сайт-специфичную query-рекомбиназу из e coli.

В этом предварительном исследовании нам удалось индуцировать рекомбинацию в большинстве солей. На этом всё. Желаем удачи в ваших экспериментах.