Измерение коэффициентов диффузии через двухфотонной флуоресценции Восстановление после фотообесцвечивания
26 февраля 2010 г.
В этой статье мы опишем методику измерения коэффициентов диффузии использованием многофотонной флуоресценции восстановления после фотообесцвечивания. Мы начнем, совместив лазерной вдоль оптического пути к образцу и определения надлежащих параметров эксперимента, а затем продолжить создание и, наконец, установка флуоресценции кривые восстановления.
Процедура многофотонного восстановления флуоресценции после фотообесцвечивания легко демонстрируется на образце со свободно диффундирующими молекулами флуоресцентного красителя. Сначала в образец направляется лазерный луч низкой интенсивности для создания базового уровня флуоресценции молекул D в фокальном объеме лазера.
Затем подается короткая высокоинтенсивная лазерная вспышка для фотообесцвечивания части молекул красителя в фокальном объеме. Наконец, интенсивность лазерного луча снижается до прежнего низкого уровня, и за флуоресценцией наблюдают по мере того, как фотообесцвеченные молекулы диффундируют наружу и замещаются всё еще флуоресцирующими молекулами из-за пределов фокального объема. Полученная кривая зависимости флуоресценции от времени анализируется для определения коэффициента диффузии.
Здравствуйте, я Келли Салливан из лаборатории Эдварда Брауна кафедры биомедицинской инженерии Университета Рочестера. Сегодня мы покажем вам, как проводить многофотонное восстановление флуоресценции после фотообесцвечивания. В нашей лаборатории мы используем этот метод для изучения диффузии в биологических системах как in vitro, так и in vivo.
Итак, приступим. Для начала установите необходимую длину волны лазера и установите соответствующий фильтр перед фотоэлектронным умножителем (ФЭУ). Затем, чтобы избежать повреждения ячейки pcal, отрегулируйте мощность лазера до 200 milliwatts или меньше.
Перед ячейкой pcal расположены два зеркала, ориентированные в форме цифры четыре. Этих зеркал достаточно для юстировки лазерного луча при прохождении через ячейку pcal. Установите смещение напряжения на контроллере смещения ячейки pcal на ноль, затем отрегулируйте путь лазера через ячейку pcal так, чтобы луч был центрирован относительно переднего и заднего окон.
Используйте зеркало, расположенное выше по потоку в схеме «четверка», чтобы центрировать пучок в переднем окне, и зеркало, расположенное ниже по потоку в схеме «четверка», чтобы центрировать пучок в заднем окне. Теперь установите напряжение на кристалле ячейки pcal на максимальное значение. Соответствующее значение зависит от длины волны и может быть найдено в руководстве по эксплуатации ячейки pcal.
Отрегулируйте зеркала, указанные на рисунке четыре перед ячейкой pcal, до достижения максимальной выходной мощности из ячейки pcal. Затем установите напряжение на кристалле равным нулю и отрегулируйте смещение напряжения на контроллере смещения, чтобы минимизировать выходную мощность из ячейки pcal. Верните мощность лазерного излучения, падающего на ячейку pcal, к значению, необходимому для эксперимента.
Теперь перейдем к микроскопу и добьемся четкой визуальной фокусировки на стандартном флуоресцентном образце. В данном случае мы используем фиксированные флуоресцентные зерна пыльцы. После фокусировки закройте микроскоп и отрегулируйте мощность лазера до уровня, подходящего для получения изображений образца, изменив напряжение на кристалле ячейки pcal.
Наконец, выключите свет и включите ФЭУ. Запустите повторное сканирование изображения стандартного образца и отрегулируйте зеркала, расположенные после ячейки pcal, до получения четкого изображения образца. Теперь перейдем к определению безопасной мощности монитора при фокусировке внутри образца.
Для целей данного видео мы будем использовать образец водного красителя, помещенный в углубление предметного стекла и накрытый покровным стеклом. Ослабьте лазер до низкой, но достаточной мощности для генерации флуоресценции в образце. Герметизируйте микроскоп, перенаправьте выходной сигнал с ФЭУ на счетчик фотонов.
Выключите свет, включите ФЭУ и запустите поточное сканирование (point scan) в программном обеспечении микроскопа. Настройте счетчик фотонов на интегрирование в течение интервала времени, который значительно превышает ожидаемое время восстановления флуоресценции, и зарегистрируйте достаточное количество точек данных. Увеличьте мощность и снимите еще одну серию данных по количеству фотонов.
Продолжайте увеличивать мощность до тех пор, пока прирост количества фотонов не начнет значительно снижаться. Рассмотрите график зависимости мощности, где логарифм количества фотонов представлен как функция логарифма мощности. Любое отклонение от наклона, равного двум, указывает на выгорание.
Во время мониторинга выберите подходящую мощность монитора, которая будет ниже этого порогового значения. Теперь определим входные параметры для многоканального скалера и генератора импульсов. На генераторе импульсов.
Установите время предварительного обесцвечивания (pre-teach time) в один-два раза больше ожидаемого времени полувосстановления, а время обесцвечивания (bleach time) на скалере — в 1/10 от ожидаемого времени полувосстановления. Установите ширину окна (bin width) примерно в половину длительности обесцвечивания и задайте количество окон на запись (number of bins per record) таким образом, чтобы произведение выбранной ширины окна и количества окон на запись превышало ожидаемое время полного восстановления. С учетом времени предварительного обесцвечивания и обесцвечивания вернитесь к генератору импульсов и установите частоту последовательности предварительного обесцвечивания и обесцвечивания равной значению, которое чуть меньше величины, обратной произведению ширины окна на количество окон на запись.
Наконец, установите количество записей на одно сканирование на скалере, исходя из интенсивности сигнала при выбранной мощности мониторинга. Теперь установите мощность мониторинга на безопасный уровень, а мощность обесцвечивания — примерно на 200 milliwatts выше порога обесцвечивания, определенного в ходе теста на обесцвечивание монитора. Оба этих значения мощности задаются как разные напряжения на уплотнении кристалла ячейки al; выключите свет в микроскопе.
Включите ФЭУ. Запустите сканирование по точкам в программном обеспечении для визуализации. Затем включите генератор импульсов и скалер.
Для анализа полученной кривой восстановления отметьте три важные точки: флуоресценцию до выжигания, флуоресценцию непосредственно после выжигания и флуоресценцию в конце набора данных. Используйте значения флуоресценции до и сразу после выжигания для более точной оценки времени полувосстановления.
Теперь, используя правила, изложенные на предыдущих этапах, обновите значения для предварительного выжигания (preble bleach) и длительности начала ширины (begin width durations). Постройте новую кривую и продолжайте корректировать параметры до тех пор, пока результирующая кривая не продемонстрирует выраженное выжигание и плавное восстановление. Проверьте наличие насыщения возбуждения, построив график зависимости логарифма параметра глубины выжигания от логарифма мощности.
Любое отклонение от наклона, равного двум, указывает на насыщение возбуждения. Выберите такую мощность обесцвечивания, которая обеспечит интенсивное выгорание, но не приведет к насыщению. Наконец, определив подходящие параметры, продолжите регистрацию кривых многофотонного восстановления флуоресценции после фотообесцвечивания (MP FRAP) вашего исследуемого образца.
Теперь мы представим репрезентативные результаты: как исходные данные FRAP для MP, так и нормализованную кривую восстановления MP F, которая была аппроксимирована для определения коэффициента диффузии. Исходные данные FRAP для MP демонстрируют выраженное выгорание и плавное восстановление. Для аппроксимации данных отчет о полном восстановлении приводится для второй половины выборки. Сначала мы нормализуем восстановление относительно средней флуоресценции до выгорания, а затем выполняем нелинейную аппроксимацию методом наименьших квадратов.
Относительно подходящей модели. Оба набора данных были получены в водном растворе флуоресцеина и позволяют определить коэффициенты диффузии. В соответствии с литературой, мы только что продемонстрировали вам, как проводить эксперимент по многофотонному восстановлению флуоресценции после фотообесцвечивания.
При выполнении данной процедуры важно проявлять осторожность и устанавливать экспериментальные параметры, в частности, продолжительность обесцвечивания, а также мощность обесцвечивания и мониторинга, в пределах безопасных значений, определенных в протоколе. Благодарим за просмотр и желаем успехов в ваших экспериментах.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье описывается процедура измерения коэффициентов диффузии с помощью многофотонного восстановления флуоресценции после фотовыжигания. Процесс включает в себя юстировку лазера по оптическому пути к образцу и аппроксимацию кривых восстановления флуоресценции.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Флуоресцентная микроскопия
- Измерение диффузии
- Методы фотообесцвечивания
Теоретическое обоснование
- Многофотонное восстановление флуоресценции после фотообесцвечивания — это метод, используемый для изучения молекулярной диффузии.
- Данный метод позволяет получить сведения о динамике флуоресцентных молекул в образце.
- Понимание коэффициентов диффузии имеет важное значение для различных биологических приложений.
- Процедура применима к образцам молекул флуоресцентного красителя, находящимся в состоянии свободной диффузии.
Цель исследования
- Продемонстрировать процедуру измерения коэффициентов диффузии.
- Представить подробную методику для исследователей в данной области.
- Углубить понимание молекулярной динамики в биологических системах.
Используемые методы
- Лазерный луч низкой интенсивности создает базовый уровень флуоресценции.
- Короткий лазерный импульс высокой интенсивности вызывает фотообесцвечивание части молекул красителя.
- За флуоресценцией следят по мере того, как фотообесцвеченные молекулы диффундируют и замещаются новыми.
- Кривые восстановления флуоресценции анализируются для определения коэффициентов диффузии.
Основные результаты
- Данная процедура позволяет эффективно измерять коэффициенты диффузии флуоресцентных молекул.
- Кривые восстановления флуоресценции предоставляют количественные данные о молекулярной динамике.
- Метод воспроизводим и может быть применен к различным образцам.
- Результаты способствуют пониманию молекулярных взаимодействий в биологическом контексте.
Выводы
- Многофотонное восстановление флуоресценции после фотообесцвечивания является ценным методом измерения коэффициентов диффузии.
- Описанная методика может быть использована исследователями для изучения молекулярной динамики.
- Дальнейшее применение этого метода может углубить наше понимание биологических процессов.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Измерение коэффициентов диффузии методом двухфотонного восстановления флуоресценции после фотовыжигания позволяет получить количественные данные о молекулярной динамике в биологических системах, что способствует валидации мишеней и снижению механистических рисков на ранних этапах поиска. Данный метод обеспечивает воспроизводимую бестмаркерную оценку транспорта макромолекул, что помогает в разработке анализов и повышает прогностическую достоверность рабочих процессов идентификации ведущих соединений. Возможность применения метода как в системах in vitro, так и in vivo улучшает трансляционную преемственность и снижает биологическую неопределенность при принятии решений на доклиническом этапе.
Стратегические приложения в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: Позволяет проверять терапевтические гипотезы путем количественной оценки диффузионного поведения макромолекул в системах, имеющих значение для конкретных заболеваний.
- Практическая ценность: Обеспечивает снижение биологических рисков за счет прямого измерения молекулярной мобильности в нативных или искусственно созданных средах.
- Прогностическая ценность: Способствует приоритизации портфеля препаратов, предоставляя показатели диффузии, которые коррелируют с взаимодействием с мишенью и кинетикой связывания.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: Подготовка валидированных биологических систем для последующего скрининга путем установления базовых параметров диффузии.
- Воспроизводимость: Обеспечение количественных данных на основе флуоресценции, что способствует стандартизации анализа между различными сериями экспериментов и лабораториями.
- Масштабируемость: Интеграция с платформами автоматизации, такими как LabVIEW, для повышения пропускной способности в кампаниях по скринингу ведущих соединений.
Трансляционные и доклинические исследования
- Значимость для изучения заболеваний: Применимо к биологическим системам in vivo, что позволяет оценивать диффузию в средах, имитирующих ткани.
- Трансляционная преемственность: Связующее звено между этапом поиска и доклиническими исследованиями за счет обеспечения согласованных биофизических показателей в различных модельных системах.
- Продвижение с учетом рисков: Обосновывает решения о целесообразности дальнейшей разработки (go/no-go) путем количественной оценки свойств молекулярного транспорта, влияющих на распределение препарата и доступ к мишени.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод вписывается в континуум разработки — от ранней валидации мишени и идентификации ведущих соединений до доклинического исследования, предоставляя биофизические данные, которые используются при молекулярном дизайне и оптимизации.
- Открывающая биология: обеспечивает проверку гипотез путем измерения изменений макромолекулярной диффузии в экспериментальных условиях, что позволяет прояснить поведение сигнальных путей и мишеней.
- Скрининг: обеспечивает готовность анализа за счет стандартизированных измерений восстановления флуоресценции, что гарантирует последовательную оценку соединений.
- Аналитика: позволяет получать количественные коэффициенты диффузии методом наименьших квадратов при аппроксимации кривых восстановления, что дает возможность объективного сравнения вариантов молекул.
- Трансляционные исследования: обеспечивают преклиническую преемственность, позволяя проводить измерения диффузии как в системах in vitro, так и in vivo, что способствует экстраполяции данных между разными масштабами.
- Корпоративное повторное использование: служит универсальной биофизической платформой для оценки молекулярной динамики в рамках множества проектов и классов мишеней.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: обеспечивает прогностическую уверенность в валидации мишени за счет снижения механистической неопределенности в отношении молекулярной мобильности и взаимодействий.
- Операционная ценность: обеспечивает стандартизацию и воспроизводимость благодаря определенным параметрам лазера, протоколам выжигания и автоматизированному сбору данных.
- Стратегическая ценность: повышает эффективность использования капитала, позволяя на ранних этапах снижать риски, связанные с мишенями, на основе биофизических профилей, полученных на основе диффузии.
- Влияние на портфель: поддерживает приоритизацию с учетом рисков путем идентификации мишеней с благоприятными характеристиками молекулярного транспорта для последующей разработки.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с двухфотонной микроскопией, методами фотообесцвечивания и количественным определением флуоресценции.
- Зависит от доступности оборудования, включая импульсные лазеры, ячейки Поккельса, счетчики фотонов и совместимые сканирующие системы.
- Необходима стандартизация мощности лазера, продолжительности обесцвечивания и параметров ширины бина для всех пользователей и центров.
- Требуется адаптация протокола при переходе от моделей с водными красителями к сложным биологическим образцам, таким как клетки или ткани.
- Метод ограничен необходимостью флуоресцентного мечения или наличием собственной флуоресценции, что может потребовать оптимизации для мишеней с низкой экспрессией.
