Живая Препарирование Drosophila Эмбрионы: Упрощенная методы скрининга Мутант Коллекции антител Окрашивание

Здесь представлена процедура сбора эмбрионов. Перенесите мух из флаконов в пробирки пятисекционной камеры для сбора. Затем поместите на верхнюю часть камеры чашку с виноградным агаром и оставьте мух для откладки яиц на несколько часов.

Когда эмбрионы достигнут нужной стадии, перенесите их с чашки с помощью кисточки на двусторонний скотч. Теперь выкатите эмбрионы из их коконов и выровняйте их на блоке агара вентральной стороной вниз. В центре мы видим предметное стекло с прямоугольником из воска и кусочком двустороннего скотча. Одним краем наложите двусторонний скотч на блок с выровненными эмбрионами и прижмите его к эмбрионам, чтобы перенести их на предметное стекло.

Теперь они будут сразу ориентированы дорсальной стороной вверх. Добавьте PBS в область предметного стекла, ограниченную восковым прямоугольником, так, чтобы покрыть эмбрионы. Сверху показан вид предметного стекла сбоку, а снизу — вид сверху.

Сделайте надрез вдоль плевральной мембраны с помощью стеклянной диссекционной иглы. Аккуратно подденьте эмбрионы в области мозга, поднимите их и расположите в ряд на стекле. Затем препарируйте каждый эмбрион для получения филе.

По завершении процедуры вы получите предметное стекло с рядами эмбрионов данио-рерио. Теперь их можно фиксировать. Здравствуйте, меня зовут Питер Ли, я аспирант в лаборатории Кайзена на факультете биологии Калтеха.

Здравствуйте, я Эшли Райт, аспирантка Калифорнийского технологического института (Caltech) из лаборатории Кайзена. Я Кайзен, профессор Caltech, моя исследовательская группа занимается изучением развития нервной системы плодовой мушки. Сегодня мы продемонстрируем вам процедуру препарирования живых эмбрионов opal.

Мы использовали данные методы для поиска лигандов сиротских рецепторов. Это осуществляется путем скрининга коллекций линий с гиперэкспрессией белков клеточной поверхности с помощью живого окрашивания эмбрионов с использованием слитых белков рецепторов. Мы также применяем эту процедуру в лаборатории для изучения эмбриональных фенотипов и проведения генетических скринингов.

Я провел скрининг дефицита двигательных актов при фенотипах нарушения ориентации. Итак, приступим. Питер покажет вам, как это делается.

Для начала с помощью шпателя нанесите небольшое количество дрожжевой пасты на планшет для сбора яиц grape agri в соответствии с каждым из бочонков камеры для сбора эмбрионов. Затем введите углекислый газ в пробирки с мухами, чтобы усыпить их. Перенесите несколько сотен мух непосредственно в камеру для сбора.

Затем накройте камеру планшетом для сбора яиц и прижмите его. Используя полоску маркировочной ленты длиной 20 дюймов, прикрепите камеру к планшету, начиная от центра агарной чашки. Лента должна заходить на планшет для сбора яиц. После пробуждения мух инкубируйте их при комнатной температуре в темноте в горизонтальном положении в течение двух или трех часов; по завершении инкубации аккуратно постучите по стенкам, чтобы мухи переместились вниз, и замените планшет для сбора.

Если в каждом секторе удаленной планшета находится менее 100 эмбрионов, продолжайте двухчасовой сбор до тех пор, пока не будет собрано достаточное количество эмбрионов. Собранные эмбрионы можно объединять в пулы в соответствии с инструкциями, изложенными в прилагаемом письменном протоколе.

Для старения эмбрионов поместите влажный фрагмент круглого фильтровального бумажного кружка диаметром 90 мм в крышку чашки Петри и переверните на него планшет для сбора эмбрионов. Инкубируйте планшет в течение необходимого времени и при заданной температуре; подготовьте предметное стекло для определения стадии развития и сортировки эмбрионов, наклеив на него двусторонний скотч. Затем поместите на предметное стекло прямоугольный фрагмент виноградного агара.

Лоток для высиживания должен быть достаточно большим, чтобы вместить от пяти до 10 рядов по 10–15 эмбрионов. Когда эмбрионы достигнут нужной стадии, извлеките их из инкубатора. Перенесите подросшие эмбрионы из планшета для сбора на двусторонний клейкий скотч.

С помощью влажной кисти равномерно распределите эмбрионы по ленте. Под GFP-диссекционным микроскопом отберите эмбрионы с соответствующей экспрессией GFP, которая указывает на генотип. В данном эксперименте генотипирование проводится путем отбора эмбрионов, у которых отсутствует экспрессия GFP балансерной хромосомы curly arm.

Поскольку генотипирование эмбрионов будет различаться в зависимости от используемого балансера, пожалуйста, обратитесь к прилагаемому письменному протоколу для получения более подробной информации о выполнении этого этапа. Затем, используя затупленную диссекционную иглу, зафиксируйте эмбрионы, осторожно прокатывая их по двустороннему скотчу. На 16-й стадии кишечник разделен на три полосы.

После этого в кишечнике в области хвоста начинают развиваться диагональные полосы, затем он сворачивается, и эмбрион становится более отчетливым. Далее с помощью препаровальной иглы перекатите каждый эмбрион на хорион или на другие эмбрионы. Избегая контакта с лентой, поднимите эмбрион и перенесите его на плашку с виноградным агаром.

Расположите покрытые эмбрионы на этой пластине дорсальной стороной к агаровой пластине, а задним концом вниз. Затем поместите предметное стекло в чашку Петри с влажной фильтровальной бумагой и инкубируйте эмбрионы при комнатной температуре до достижения нужного возраста. Для препарирования подготовьте предметное стекло для живой диссекции, вырезав небольшой прямоугольный кусочек двустороннего клейкого скотча. С помощью воскового карандаша закрепите скотч у одного из краев предметного стекла Super Frost Plus.

Нарисуйте вокруг ленты прямоугольник шириной с предметное стекло и длиной от 30 до 40 мм. Между воском и лентой должно оставаться примерно три мм пространства. Затем перенесите эмбрионы с плитки большой чашки Петри на ленту, перевернув предметное стекло и осторожно опустив его на выровненных эмбрионов так, чтобы лента соприкоснулась с ними.

Эмбрионы следует ориентировать задними концами вниз. После переноса эмбрионы окажутся на предметном стекле дорсальной стороной вверх; с помощью стеклянной диссекционной иглы, изготовленной на вытягивателе игл (по аналогии с инъекционной иглой), немедленно добавьте XPBS поверх эмбрионов, чтобы заполнить восковой прямоугольник. Сделайте разрез вдоль дорсальной срединной линии, начиная от заднего конца эмбриона.

Теперь осторожно коснитесь переднего конца эмбриона и приподнимите его. Начиная с нижнего, переносите эмбрионы в правую часть к полоске скотча, удерживая их в буфере. Продолжайте препарирование и перенос эмбрионов, формируя на предметном стекле упорядоченный ряд, соответствующий каждому ряду на планшете для культивирования.

С помощью препаровальной иглы аккуратно прижмите лоскуты брюшной стенки к предметному стеклу, избегая растяжения или удаления материала с их поверхности. Игла должна касаться только передних и задних углов дорсальных краев брюшной стенки.

Поскольку моторные аксоны не простираются так далеко. В дорсальном направлении избегайте касания игл предметного стекла, иначе оно сломается после того, как все эмбрионы будут перенесены и закреплены на стекле. Удалите кишечник из каждого эмбриона, перерезав его в четырех местах в области мозга и вытянув весь кишечник из эмбриона.

Выместите заднюю кишку на предметное стекло. После завершения всех этапов препарирования с помощью двух пипеток Пастера одновременно введите 5% формальдегид комнатной температуры в один угол воскового прямоугольника и удалите раствор из противоположного угла. Замените фиксирующий раствор трижды, используя общий объем около six milliliters.

Инкубируйте эмбрионы в фиксирующем растворе в течение 45 минут. Очень важно не допускать контакта мениска с эмбрионами, так как это приведет к их повреждению. С помощью пастер-пипетки удалите большую часть фиксирующего раствора.

Промойте образцы раствором PB S 3 раза, используя метод двух пастурных пипеток. Затем трижды промойте их раствором PBT для пермеабилизации эмбрионов. Этот этап также снижает чувствительность эмбрионов к эффекту мениска.

После финальной промывки осторожно удалите PBT, наклонив предметное стекло, и кратковременно приложите салфетку Kimwipe к углу области, ограниченной воском, чтобы удалить излишки раствора. С помощью предварительно заполненного дозатора немедленно добавьте 200 microliters блокирующего раствора и инкубируйте в течение 10–30 минут. После этого удалите блокирующий раствор с помощью салфетки Kimwipe при комнатной температуре.

Затем немедленно добавьте 200 µL выбранной первичной антителы, разведенной в блокирующем растворе. Поместите предметное стекло в увлажненный контейнер и инкубируйте в течение ночи при 4 °C. В данном эксперименте для маркировки моторных аксонов используется моноклональное антитело 1D4.

На следующий день достаньте чашки из холодильника (+4 °C) и трижды промойте эмбрионы в растворе PBT на качалке, выдерживая их не менее 15 минут при каждой промывке. На всех этапах промывки следите за тем, чтобы объема PBT было достаточно для полного погружения предметного стекла во время качания. После промывки эмбрионов проведите блокировку стекла, как описано ранее.

Сразу после блокировки добавьте 200 µL вторичного антитела в блокирующем растворе и инкубируйте в течение двух часов при комнатной температуре; в данном случае используется Alexa 488 goat anti-US. Вторичное антитело применяется совместно с Rodine Phin для маркировки мышечных волокон. Затем снова проведите промывку трижды раствором PBT на качалке, по крайней мере по 15 минут на каждую промывку.

Перенесите предметные стекла в другой кювет, чтобы удалить остатки моющего средства. Затем промойте их дважды в PBS по пять минут. Извлеките предметное стекло из PBS, удалите большую часть оставшегося PBS из лунки с помощью безворсовой салфетки и немедленно добавьте 500 µL 70% глицерина.

Поскольку глицерин имеет такой же показатель преломления, как и эмбрион, выполнение данного этапа сделает окрашивание более заметным; промойте эмбрионы в течение двух часов при комнатной температуре или в течение ночи при 4 °C. Затем удалите глицерин с помощью салфетки Kimwipe. Удаление почти всего глицерина приведет к уплощению эмбрионов, тогда как удаление меньшего количества позволит сохранить более трехмерную структуру.

После удаления глицерина накройте образец покровным стеклом номер один. Эмбрионы готовы к визуализации; препарированные и окрашенные эмбрионы можно исследовать с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии. Здесь представлен препарированный эмбрион, окрашенный антителами 1D4 к аксонам моторных нейронов.

Это изображение по виду похоже на более распространенные снимки, где для визуализации методом иммунофлуоресценции использовался пероксидаза хрена (HRP) иммуногистохимический анализ. Можно получить изображения более высокого качества, на которых детали ветвлений моторных аксонов видны более четко. Сопутствующее окрашивание с использованием меченого rho domine phin, который связывается с актином, позволяет одновременно визуализировать мышцы.

Это дает более четкое представление о послойном расположении и организации мышц, чем при окрашивании HRP. Здесь моторные аксоны показаны зеленым цветом, а мышцы — красным. Мы только что продемонстрировали, как выделять живые эмбрионы drosophila из коллекций мутантных линий. При выполнении этих процедур важно начинать с простых линий, таких как сбалансированные стоки lio, armadillo, GFP, и обрабатывать лишь несколько линий за раз.

По мере того как вы будете набираться опыта и скорости в проведении диссекций, вы сможете обрабатывать до 10 линий в день, что позволит вам проскринировать коллекцию из примерно 200 мутантных линий за период около 20 дней. Таким образом, эта процедура становится очень эффективной, когда вы в совершенстве овладеете всеми этапами ее выполнения. На этом всё, спасибо за внимание и успехов в ваших экспериментах.