Изготовление и эксплуатация Кислород Вставка для Приверженец клеточных культур

Устройство для создания гипоксии представляет собой вставку с шестью колонками, которые помещаются в лунки шестилуночного планшета. Газ проходит через микрофлюидную сеть в основании колонки и диффундирует через газопроницаемую мембрану из PDMS, разделяющую газовую сеть и культуральную среду. Данное устройство минимизирует длину пути диффузии между источником кислорода (микрофлюидной сетью в основании колонки) и клетками, что обеспечивает более быстрое установление равновесия по концентрации кислорода.

Устройство также обеспечивает гораздо более точный контроль над пространственным распределением кислорода, воздействующего на клетки; этот паттерн определяется конструкцией микрофлюидной газовой сети, созданной методом стандартной фотолитографии с использованием фотошаблонов. Здравствуйте, я Шон Ард из лаборатории доктора Дэвида Эдингтона на кафедре биоинженерии Иллинойского университета в Чикаго. Здравствуйте, я Элли, также из лаборатории Эдингтона.

Сегодня мы покажем вам, как изготовить, проверить и использовать специальное устройство для воздействия различных концентраций кислорода на клеточные культуры in vitro в шестилуночном планшете. Мы применяем эту процедуру в нашей лаборатории для изучения влияния кислорода на заживление ран, генерацию активных форм кислорода и миграцию клеток. Итак, приступим.

Для начала изготовления оксигенирующей вставки приготовьте полиметилсилоксан (PDMS), смешав преполимер и отвердитель в соотношении 10:1. Согласно инструкциям производителя, смесь PDMS заливают в предварительно изготовленную форму из тефлона, профиль которой имитирует форму стандартного 6-луночного культурального планшета. После отверждения при температуре 75 °C в течение ночи полученная реплика в виде массива столбиков станет первым из трех компонентов, из которых состоит оксигенирующая вставка, для последующего изготовления второго ключевого компонента оксигенирующей вставки.

Матрица из SU-8 изготавливается путем центрифугирования SU 8 21 50. На кремниевую подложку накладывается фотошаблон, после чего SU-8 подвергается УФ-облучению через фотошаблон для создания мастер-формы с толщиной микроканалов 300 µm. Сверху на матрицу из SU-8 наливают PDMS и подвергают отверждению в течение двух часов при 75 °C для получения позитивной формы, которая в конечном итоге сформирует микроканалы у основания каждого столбика.

Третий компонент устройства изготавливают путем центрифугирования PDMS на кремниевой пластине при 500 RPM в течение 10 секунд, после чего скорость увеличивают до 900 RPM на 30 секунд для получения мембраны толщиной 100 µm. Поскольку PDMS газопроницаем, кислород может подаваться в микроканалы непосредственно через эту мембрану. После подготовки всех компонентов каждую поверхность соединения подвергают обработке кислородной плазмой в течение одной минуты.

С помощью ручного плазменного устройства сначала прикрепите шесть компонентов микроканалов к массиву столбиков, затем проделайте в каждом столбике по два отверстия, которые будут служить входами и выходами для газа. Наконец, прикрепите мембрану к нижней части микроканала, чтобы облегчить соединение и удалить пузырьки воздуха. Поверхности, обработанные плазмой, прижимают друг к другу в течение примерно одной минуты тупым концом пинцета; между каждым этапом соединения следует выждать один час, чтобы убедиться, что устройство полностью закреплено и может быть откалибровано.

После изготовления готового устройства необходимо откалибровать уровень кислорода, который получают клетки при использовании оксигенирующей вставки в реальных экспериментах. Для калибровки используйте флуоресцентный датчик кислорода или foxy-слайд, имеющий покрытие из флуоресцентного красителя на основе рутения, который гасится кислородом. Foxy-слайды предварительно нарезаны по размеру для установки на дно шестилуночного планшета.

Стеклянное предметное стекло следует обрезать так, чтобы оно максимально закрывало поверхность лунки. Поскольку толщина предметного стекла составляет около одного миллиметра, модифицируйте устройство, чтобы обеспечить необходимое расстояние для адекватной диффузии через мембрану.

Это расстояние зависит от эксперимента, но в большинстве случаев оно должно составлять менее одного миллиметра. Используя ручное плазменное устройство, вырежьте из стекла толщиной 1 мм четыре опоры для предметного стекла микроскопа длиной примерно 6 мм и шириной 4 мм и прикрепите их к нижней части устройства. Устройство будет опираться на эти опоры, расположенные на предметном стекле.

Для валидации потребления кислорода с использованием диффузионного зазора 0,17 мм также можно использовать стеклянные покровные стекла. Добавьте по 3 мл деионизированной воды комнатной температуры в лунки планшета на шесть лунок, в которых будет измеряться уровень кислорода. Поместите устройство в планшет и с помощью программного обеспечения Metamorph выберите номер и расположение необходимых позиций на датчике Foxy.

Переместите слайд для анализа концентрации кислорода. Соедините трубки тай-гана между баллоном с кислородом и устройством гипоксической вставки. Для точного контроля подаваемого газа используется прецизионный регулятор расхода, настроенный на скорость потока от 50 до 100 milliliters per minute.

Убедитесь, что прецизионный регулятор расхода закрыт. Сначала откройте верхний регулятор баллона, затем прецизионный регулятор. Через 15 минут снизьте скорость потока до 10–20 в минуту.

Чтобы избежать образования пузырьков воздуха в воде, внимательно следите за значением скорости потока в течение следующего часа и вносите коррективы по мере необходимости, так как перепад давления будет меняться по мере уравновешивания системы, что повлияет на скорость потока при получении изображений планшета и датчиков foxy. Используются микроскоп Olympus IX 71 с флуоресцентным оборудованием, ПЗС-камера Tiga от Q Imaging, а также программное обеспечение для сбора изображений SRV и Metamorpho. Микроскоп оснащен фильтром Olympus 3 1 0 2 0 — флуоресцентным фильтром, совместимым с foxy, с длиной волны возбуждения 475 nanometers и длиной волны эмиссии 600 nanometers.

Для проверки времени уравновешивания и степени оксигенации устройства выберите три точки на предметном стекле foxy, в которых будет измеряться концентрация кислорода. Сделайте снимок стекла непосредственно перед началом подачи газа. В течение 30 минут подачи газа через устройство делайте снимки с интервалом в 10 секунд, чтобы проверить неоднородность и доставку кислорода.

Установите несколько точек с интервалом в 1 мм по всей ширине канала и измерьте концентрацию кислорода на поверхности лунки с помощью программы Metamorph. Экспортируйте среднюю интенсивность изображения для каждой позиции и постройте график зависимости концентрации оксигенации от интенсивности флуоресценции. Постройте калибровочную кривую, аппроксимируя линейными кривыми участки от 0 до 10% и от 10 до 21%, чтобы установить зависимость интенсивности флуоресценции от концентрации кислорода. Для каждой измеренной позиции необработанные данные об интенсивности можно экспортировать из Metamorph и подвергнуть дальнейшему анализу в Microsoft Excel или другом статистическом программном обеспечении.

После калибровки устройства можно приступать к проведению экспериментов, таких как анализ заживления ран; простерилизуйте откалиброванную вставку в автоклаве при 121 °C в течение 15 минут не позднее чем за 24 часа до начала эксперимента и работайте с ней в ламинарном боксе для предотвращения последующего загрязнения. Замочите стерилизованную вставку из PDMS в безсывороточной среде на 24 часа, чтобы предотвратить образование пузырьков газа при установке в лунки планшета; культивируйте клетки MDCK или другие адгезивные клетки до 100% конфлюэнтности в шестилуночном планшете, затем создайте прямые царапины в монослоях с помощью наконечника дозатора P 200. Эти царапины имитируют раны в адгезивном монослое.

Отоснимите культуральную среду, не нарушая целостность монослоя, и промойте среду пятью миллилитрами среды. Снова отоснимите жидкость и заполните лунки тремя миллилитрами безсывороточной среды. Осторожно установите устройство в планшет, стараясь избегать образования пузырьков воздуха.

Установка устройства под углом при введении помогает вытеснить пузырьки воздуха с одной стороны. Будьте осторожны, чтобы не оказать избыточного давления на устройство, так как это может привести к деформации PDMS и повреждению нижележащих клеток. Поместите планшет и устройство на предметный столик микроскопа с подогревом до 37 °C и подсоедините трубки от баллона с источником газа к входному и выходному портам устройства.

В инкубаторе для культур должен быть предусмотрен otwór для ввода трубок, и трубки должны быть подключены. После помещения устройства в инкубатор выполните ту же процедуру запуска потока газа, которая была описана ранее для оценки заживления ран. Снимайте изображения клеток в режиме таймлапс каждые 20 минут в течение 15–18 часов, используя оборудование и программное обеспечение для визуализации, описанные ранее. Для анализа незажившей площади поверхности по истечении требуемой продолжительности эксперимента можно использовать алгоритм измерения площади «царапины» (T scratch). Остановите поток газа, извлеките планшет и, при необходимости, перейдите к дальнейшей обработке клеток. Устройству с гипоксической вставкой требуется менее двух минут для стабилизации уровня кислорода до 0,5%, как показано здесь.

Размер зазора в нижней части мембранной лунки устройства был критическим фактором, определяющим эффективность уравновешивания, при этом при больших размерах зазора требовалось больше времени для достижения стационарных значений концентрации кислорода. Устройство также обеспечивает значительный контроль над пространственным оксигенированием в одной лунке, что позволяет создавать несколько условий и даже генерировать циклический профиль кислорода по всей поверхности лунки. Монослои клеток MDCK подвергались воздействию 10% или 21% кислорода, и площадь поверхности раны анализировалась с течением времени с использованием алгоритма отслеживания царапин MATLAB Ts scratch wound tailing.

Спустя 11 часов из 17 общего времени эксперимента, при воздействии 10% кислорода сохранилось 6.87% от первоначальной площади раны, в то время как при 21% кислорода сохранилось 64.4% площади раны. Как показано здесь, для обеих концентраций кислорода наблюдается отрицательная корреляция между концентрацией кислорода и площадью открытой раны. Таким образом, мы продемонстрировали способ изготовления, валидации и использования устройства с гипоксической вставкой для анализа заживления царапин. Данное устройство обладает рядом преимуществ перед другими системами оксигенации, такими как меньшие габариты лабораторного оборудования и значительно более точный контроль пространственного и временного оксигенирования на поверхности клеток.

Данное устройство может быть использовано практически в любой лаборатории, изучающей влияние кислорода или других газов, таких как диоксид углерода, на клеточные культуры in vitro. При выполнении данной процедуры важно выдержать стерилизованное устройство и культуральные среды в замачивании в течение ночи, а также свести к минимуму образование пузырьков во время эксперимента. Кроме того, перед началом эксперимента дайте системе прийти в равновесие.

Это происходит потому, что скорость потока изменяется по мере выравнивания давления в системе. На этом всё. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.