Многоцветный проточной цитометрии Анализ клеточного иммунного ответа на резус-макак
22 апреля 2010 г.
Мы демонстрируем полезность многоцветной проточной цитометрии для подробного фенотипические и функциональные характеристики от общего числа, а также памяти подмножеств CD4 + и CD8 + Т-клеток у макак-резус, идеальная модель для борьбы с ВИЧ / СПИД исследования вакцины.
В данном видео демонстрируется процедура стимуляции и окрашивания мононуклеарных клеток периферической крови или PBMC. Для многоцветного анализа методом проточной цитометрии изолированные из цельной крови PBMC помещают в планшеты для культивирования тканей. Клетки подвергают химической или биологической стимуляции для вызывания иммунного ответа.
После стимуляции добавляют коктейль антител для идентификации типов клеток на основе экспрессируемых поверхностных маркеров. Затем клетки пермеабилизируют и добавляют другой коктейль антител для обнаружения экспрессии внутриклеточных цитокинов, после чего клетки анализируют методом проточной цитофлуориметрии для определения профилей цитокинов специфических подмножеств PBMC. Здравствуйте, я Эми Кортни из лаборатории доктора Джагана САС на кафедре иммунологии Техасского онкологического центра имени М.Д. Андерсона.
Здравствуйте, я Хонг, также из этой лаборатории. Сегодня мы продемонстрируем вам мультипараметрический цитометрический анализ Т-клеточного ответа. Мы используем эту процедуру в нашей лаборатории для изучения клеточного иммунного ответа у макаков-резусов.
Итак, приступим. Начните выполнение данного протокола с использования гемоцитометра для определения количества жизнеспособных клеток PBMC, полученных от Reuss Maca, методом исключения трипанового синего красителя. Работайте в ламинарном шкафу reus.
Суспендируйте клетки в полной среде до концентрации 10 миллионов клеток на миллилитр; для неспецифической стимуляции внесите по 100 микролитров клеточной суспензии в каждую лунку 96-луночного планшета для культивирования тканей. Затем добавьте 100 микролитров среды, содержащей PMA и CIN, чтобы довести общий объем до 0.2 миллилитра с конечной концентрацией 50 нанограмм на миллилитр PMA и 500 нанограмм на миллилитр CIN; в лунки отрицательного контроля добавьте по 100 микролитров только полной среды. Инкубируйте клетки при 37 градусов Цельсия в увлажненной атмосфере с 5% carbon dioxide в течение 1.5 часов.
Добавьте felden A в культуру до конечной концентрации 10 µg/mL и инкубируйте еще 4,5 часа. felden A добавляется к trapp cytokines в аппарате gold G для повышения видимости при иммуноокрашивании; после стимуляции центрифугируйте образец для удаления среды, затем промойте, добавив 200 µL холодного промывочного буфера для проточной цитометрии, и центрифугируйте на низкой скорости. Повторите промывку, затем ресуспендируйте в 50 µL промывочного буфера для проточной цитометрии.
Теперь клетки готовы к окрашиванию на экспрессию поверхностных маркеров в каждой лунке с ресуспендированными клетками. Добавьте 1 µL живого/мертвого фиксируемого флуоресцентного красителя Aqua, приготовленного в соответствии с инструкциями производителя. Инкубируйте при 4 °C в темноте в течение 30 минут.
Приготовьте в микропробирках растворы для окрашивания, которые будут использоваться для анализа. Сначала приготовьте окрашивающий коктейль, содержащий следующие компоненты в соответствующих пропорциях: титрованные флуоресцентно-меченые моноклональные антитела anti CD3 PE SCI7, anti CD8 Alexa 700, anti CD28 per CCP SCI 5.5, anti CD95 APC и anti CD4 Pacific Blue, а также буфер для промывки Flow Wash Buffer.
Затем подготовьте контроли компенсации, которые будут использованы для определения коэффициентов перекрытия каждого отдельного красителя в другие детекторы; для этого подготовьте пробирку с каждым флуоресцентно-конъюгированным антителом по отдельности в качестве одноцветного окрашивания. В завершение подготовьте контроли «флуоресценция минус один» (FMO), смешав все реагенты, кроме исследуемого. Они будут использованы для определения границы между положительной и отрицательной популяциями путем дублирования уровней автофлуоресценции и данных, присутствующих в полностью окрашенных образцах.
После инкубации клеток с красителем для определения жизнеспособности (live/dead stain) один раз промойте их холодным буфером для проточной цитометрии, чтобы удалить избыток красителя, и аспирируйте буфер. Затем добавьте подготовленные окрашивающие растворы. Инкубируйте клетки при температуре 4 °C в темноте в течение 30 минут.
Промойте окрашенные клетки холодным буфером для проточной цитометрии, чтобы удалить избыток антител. Затем добавьте 100 µL раствора для фиксации и пермеабилизации BD и выдержите не менее 10 минут. Храните клетки при температуре 4 °C в темноте до 24 часов до момента использования или переходите к окрашиванию внутриклеточных цитокинов.
Сначала пермеизируйте клетки в 100 µL 1X буфера для промывки при пермеизации; инкубируйте в течение 10 минут при 4 °C в темноте. Пока клетки инкубируются, приготовьте окрашивающие антитела, контроли компенсации и FMO-контроли в 1X буфере для промывки при пермеизации, как описано ранее.
После инкубации клеток в течение 10 минут центрифугируйте их и удалите 1x буфер для промывки с пермеабилизатором. Добавьте соответствующие окрашивающие антитела. Затем инкубируйте клетки с антителами в течение 60 минут при температуре 4 °C в темноте.
Дважды промойте клетки пермеабилизирующим раствором. После окончательной промывки ресуспендируйте клетки в 1% растворе параформальдегида в DPBS для их фиксации. Храните клетки при температуре четырех градусов Цельсия в темноте до момента использования, но не более 24 часов.
После окрашивания клеток используйте проточный цитометр LSR II или CytoDP для проведения FACS-анализа. Затем проанализируйте полученные данные с помощью FlowJo или аналогичного программного обеспечения. Состав PBMC у reuss Maca был определен с помощью FACS-анализа.
На этом рисунке представлена схема гейтирования, использованная для анализа различных субпопуляций T-клеток у одного репрезентативного животного. Сначала лимфоциты отбирали по параметрам прямого светорассеяния FSC и бокового светорассеяния SSC, после чего живые лимфоциты идентифицировали на основе SSC и популяции, отрицательной по AQUA. Затем определяли T-клетки по экспрессии CD3; в популяции T-клеток CD3-положительных также были определены популяции CD4-положительных CD8-отрицательных и CD4-отрицательных CD8-положительных клеток.
T-клетки, экспрессирующие CD4 и CD8, были дополнительно разделены на различные подмножества — наивные клетки, клетки центральной памяти и эффекторные клетки памяти — на основании экспрессии CD28 и CD95. На данном рисунке показана продукция интерферона гамма и IL-2 в нестимулированных, а также стимулированных PMA и ионофором кальция (CIN) CD4-положительных T-клетках и их подмножествах.
Обратите внимание на различные профили цитокинов, вызванные стимуляцией в каждой субпопуляции. Мы продемонстрируем вам, как проводить многопараметрический проточный цитометрический анализ PBMC.
При выполнении данной процедуры важно не забыть подготовить как контроли компенсации для каждого отдельного красителя, так и контроли с отсутствием одного флуорохрома (FMO). Оба этих вида контролей необходимы для правильного анализа данных проточной цитометрии. Пожалуйста, обратитесь к нашему письменному протоколу для получения дополнительной информации по выбору контролей компенсации.
Также помните, что при использовании антител с флуоресцентной меткой важно закрывать образцы для защиты от воздействия света. На этом всё. Благодарим за просмотр и желаем успехов в ваших экспериментах.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном видео демонстрируется процедура стимуляции и окрашивания мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК) для многоцветного анализа методом проточной цитометрии. Исследование сосредоточено на фенотипической и функциональной характеристике субпопуляций CD4+ и CD8+ T-клеток у макак-резусов, которые используются в качестве модели для исследования вакцин против ВИЧ/СПИДа.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Иммунология
- Проточная цитометрия
- Исследования ВИЧ/СПИДа
Теоретические сведения
- Макаки-резус используются в качестве модели для изучения ВИЧ/СПИДа.
- Понимание подмножеств Т-клеток имеет решающее значение для разработки вакцин.
- Многоцветная проточная цитометрия позволяет проводить детальный анализ иммунных клеток.
- PBMC являются ключевыми компонентами при изучении иммунных ответов.
Цель исследования
- Для характеристики общего пула и подмножеств Т-клеток памяти.
- Для использования многоцветной проточной цитометрии с целью детального иммунного профилирования.
- Для углубления понимания иммунных ответов в контексте ВИЧ/СПИДа.
Используемые методы
- Выделение PBMC из цельной крови.
- Химическая или биологическая стимуляция PBMC.
- Использование коктейлей антител для идентификации типов клеток и поверхностных маркеров.
- Анализ профилей цитокинов с помощью проточной цитометрии.
Основные результаты
- Успешная стимуляция и окрашивание PBMC для последующего анализа.
- Идентификация специфических субпопуляций Т-клеток на основе поверхностных маркеров.
- Характеристика экспрессии внутриклеточных цитокинов.
- Получение данных об иммунных ответах, имеющих значение при ВИЧ/СПИДе.
Выводы
- Многоцветная проточная цитометрия эффективна для анализа Т-клеток.
- Макаки-резус предоставляют ценные данные для исследований вакцин против ВИЧ.
- Понимание динамики Т-клеток необходимо для разработки эффективных методов терапии.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Многоцветная проточная цитометрия позволяет проводить точное фенотипическое и функциональное профилирование субпопуляций Т-клеток у макак-резусов, которые являются важнейшей доклинической моделью для разработки вакцин против ВИЧ. Данный подход способствует валидации мишеней путем количественной оценки иммунных ответов с продукцией цитокинов, что позволяет принимать решения о целесообразности дальнейшей разработки на ранних этапах поиска. Метод повышает прогностическую достоверность, связывая антигенспецифическую стимуляцию с измеримым выходом внутриклеточных цитокинов в определенных популяциях клеток памяти.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: Позволяет проверять терапевтические гипотезы путем измерения продукции IFN-γ и IL-2 в субпопуляциях CD4+ и CD8+ T-клеток после стимуляции.
- Практическая ценность: Обеспечивает качественную и количественную оценку экспрессии внутриклеточных цитокинов для устранения неопределенности в механизмах при валидации иммунных мишеней.
- Научная ценность: Способствует снижению биологических рисков за счет высокочувствительного обнаружения малых фракций антигенспецифических T-клеток в образцах PBMC вакцинированных животных.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Подготовка валидированных биологических систем для последующих этапов анализа путем установления стандартизированных протоколов окрашивания и стимуляции для воспроизводимого иммунного профилирования.
- Практическая ценность: Решение вопросов стандартизации и воспроизводимости анализа за счет использования контролей компенсации и контролей FMO для обеспечения точного гейтирования популяций.
- Научная ценность: Подтверждение готовности к скринингу путем обеспечения возможности определения профилей цитокинов в наивных T-клетках, T-клетках центральной памяти и T-клетках эффекторной памяти.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Обсуждается значимость для изучения заболевания путем сопоставления показателей внутриклеточных цитокинов у макак-резусов с патогенезом ВИЧ и иммунным ответом, индуцированным вакциной.
- Практическая ценность: Описывается преемственность процесса от этапа открытия до доклинической валидации путем установления связи между результатами стимуляции PBMC и функциональной характеристикой T-клеток.
- Научная ценность: Основное внимание уделяется прогностической оценке рисков путем использования продукции цитокинов в качестве функционального показателя для оценки иммуногенности вакцины.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод занимает определенное место в континууме исследований — от раннего иммунологического профилирования до идентификации перспективных соединений-лидеров, обеспечивая проверку гипотез и уточнение сигнальных путей в моделях инфекционных заболеваний.
- Фундаментальная биология: Объясняется, каким образом данный метод способствует проверке гипотез путем количественного определения продукции цитокинов в специфических субпопуляциях Т-клеток после стимуляции PMA/иономицином или антигенспецифической стимуляции.
- Скрининг: Описывается готовность анализа благодаря стандартизированной стимуляции, поверхностному и внутриклеточному окрашиванию, а также проточной цитометрической анализе образцов PBMC.
- Аналитика: Выделяются такие показатели, как частота продукции IFN-γ и IL-2, которые позволяют сравнивать иммунные ответы при различных условиях и в разных субпопуляциях.
- Трансляционные исследования: Метод обеспечивает преемственность доклинических исследований, связывая индуцированные вакциной Т-клеточные ответы у макаков-резусов с функциональным иммунным профилированием, имеющим значение для разработки вакцин против ВИЧ.
- Повторное использование в масштабах организации: Метод представлен как многократно используемый инструмент для лонгитюдного иммунного мониторинга различных кандидатов в вакцины и составов адъювантов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышение прогностической достоверности, валидация мишеней, снижение механистической неопределенности в иммунных ответах, опосредованных T-клетками.
- Операционная ценность: Стандартизация, воспроизводимость и масштабируемость многоцветных анализов проточной цитометрии для иммунного профилирования.
- Стратегическая ценность: Оптимизация принятия решений о продолжении или прекращении разработок (go/no-go), эффективность использования капитала и снижение биологических рисков на поздних стадиях программ разработки вакцин.
- Влияние на портфель: Приоритизация и решения о продвижении проектов с учетом рисков на основе количественных профилей цитокинов в доклинических моделях.
Особенности реализации
- Необходимый научный опыт в разработке панелей для проточной цитометрии, компенсации и стратегии гейтирования для многоцветного иммунофенотипирования.
- Потребности в инструментарии и аналитической инфраструктуре, включая проточный цитометр (например, LSR II) и программное обеспечение (например, FlowJo) для анализа многомерных данных.
- Требования к межкомандной стандартизации условий стимуляции, титрования антител и настройки контролей (одноцветных и FMO) между лабораториями.
- Вопросы адаптации для различных модельных систем, включая оптимизацию концентраций стимуляторов и времени инкубации для PBMC нечеловеческих приматов.
- Практические ограничения, подтвержденные исходными материалами: необходимость защиты флуоресцентных антител от света и тщательное титрование для минимизации перекрытия сигналов в многоцветных панелях.
