Кристофер Хьюз: в пробирке модель для изучения ангиогенеза (Интервью)

Здравствуйте, меня зовут доктор Кристофер Хьюз. Я профессор Калифорнийского университета в Ирвайне, и моя лаборатория занимается изучением ангиогенеза. В частности, нас интересуют гены, которые регулируют процесс ангиогенеза.

Мы оптимизировали метод анализа in vitro, основанный на работе Нельсона; с помощью этого анализа мы можем изучать все различные процессы, происходящие во время ангиогенеза. Мы покрываем бусины Tedex, небольшие бусины, эндотелиальными клетками, затем заключаем их в фибриновые гели и добавляем факторы роста.

В течение нескольких дней эндотелиальные клетки начинают прорастать из бусин. Они мигрируют, выстраиваются, пролиферируют, формируют трубки, разветвляются и создают анастомозы. Таким образом, примерно через 10 дней в культуре развивается полноценная капилляроподобная сеть.

Некоторые проблемы с тестами на ангиогенез in vivo, например, проводимыми на мышах, заключаются в том, что такой системой довольно сложно манипулировать. Трудно визуализировать происходящее внутри животного; вы не можете в реальном времени наблюдать процесс ангиогенеза. В то же время в наших культурах in vitro манипулировать системой гораздо проще: можно генетически модифицировать эндотелиальные клетки, активировать или подавлять экспрессию генов и изучать влияние этих действий на прорастание сосудов при ангиогенезе.

И сделать это гораздо сложнее на целом животном. Вам придется создавать нокаутные или нокин-линии. Таким образом, это два основных преимущества.

Его легко манипулировать и легко визуализировать. Поэтому за прошедшие годы было разработано множество различных методов анализа ангиогенеза in vitro, и каждый из них имеет свои преимущества и недостатки. В частности, одним из широко известных является анализ на матригеле, при котором эндотелиальные клетки помещают на поверхность этого внеклеточного матрикса, называемого Matrigel.

Проблема здесь заключается в том, что эндотелиальные клетки образуют шнуроподобные структуры, но так и не создают полноценных просвечивающих сосудов. Не наблюдается ни прорастания, ни анастомоза. Существуют модели на коллагеновом геле, которые могут быть эффективны.

Таких образцов много. Пролиферация эндотелиальных клеток не наблюдается. Анастомозы также обычно не обнаруживаются. Разработанный нами метод анализа с использованием фибринового геля основан на модели Нельсона Кара, опубликованной в середине девяностых годов.

Теперь мы значительно усовершенствовали этот процесс так, что можем наблюдать все стадии ангиогенеза. Мы можем видеть начальное прорастание, миграцию. Мы наблюдаем пролиферацию клеток, формирование просвета, ветвление и, в конечном итоге, анастомоз, в результате чего in vitro формируется полноценная сосудистая сеть.

Таким образом, мы полагаем, что данный анализ действительно является лучшей системой in vitro для изучения всех этих различных стадий ангиогенеза. Еще одним преимуществом этого анализа in vitro является возможность проведения лазерного микродиссекционного захвата: мы можем центрифугировать культуру до достижения очень плоского состояния, а затем использовать микроскоп для лазерного микродиссекционного захвата. Это позволяет нам извлекать отдельные клетки, и в частности нас интересуют клетки-лидеры (tip cells).

Таким образом, мы вырезаем эти участки, что позволяет нам изучить экспрессию генов, в частности, в клетках кончиков по сравнению с клетками ствола — теми клетками, которые фактически формируют просвет. Наша гипотеза заключается в том, что между этими двумя популяциями клеток будет наблюдаться дифференциальная экспрессия генов. Мы можем исследовать это, в то время как в системе in vivo сделать это было бы практически невозможно.

Таким образом, мы считаем, что это еще одно важное преимущество использования данного анализа in vitro. В ранних работах по этому направлению, о которых я упоминал, Нельсон и Рекон использовали микрососудистые эндотелиальные клетки. Считается, что микрососудистые эндотелиальные клетки — это именно те клетки, которые следует использовать для такого анализа, поскольку in vivo именно микрососудистые ЭК в действительности участвуют в формировании новых сосудов.

Мы решили попробовать выполнить это с использованием ве. Это эндотелиальные клетки пуповины человека по нескольким причинам. Одна из них заключается в том, что эти клетки очень легко получить.

Вы можете обратиться в больницу, получить пуповины в родильных залах и очень легко выделить клетки. Кроме того, эти клетки используются в культуре на протяжении многих лет и они очень хорошо охарактеризованы.

Таким образом, мы разработали и оптимизировали данный анализ, чтобы иметь возможность использовать эти клетки по указанным причинам. Интересно, что выяснилось следующее: эндотелиальные клетки крупных сосудов в культуре, по-видимому, приобретают характеристики микрососудистых эндотелиальных клеток. Они перестают экспрессировать многие гены, которые обычно экспрессируются эндотелиальными клетками крупных сосудов, и начинают экспрессировать гены, которые обычно ассоциированы с микрососудистыми эндотелиальными клетками.

Они полностью способны формировать капилляроподобные ростки, создавать просветы и в целом выглядеть в культуре как настоящие капилляры. Таким образом, они удобны в использовании, и они выполняют требуемые функции: они прорастают и формируют полноценные сосуды с просветом.

При количественной оценке данного анализа можно использовать несколько подходов. Мы можем опираться на строго количественные критерии, такие как количество ростков, длина ростков, диаметр ростков, число точек ветвления, число анастомозов, но также мы учитываем и качественные критерии. В частности, мы можем оценить, формируются ли просветы.

И это, пожалуй, то, что нас больше всего интересует. Во многих проводимых нами анализах мы оцениваем правильность формирования просвета сосудов. Это в большей степени качественная оценка, хотя по мере увеличения сосудов можно измерять и диаметр этих просветов.

Для этих культур мы используем фибробласты. Мы встраиваем микросферы в фибриновый гель и высеваем фибробласты на поверхность геля. Фибробласты абсолютно необходимы для правильного прорастания сосудов и формирования просвета.

В отсутствие фибробластов наблюдается некоторое прорастание. Однако эндотелиальные клетки имеют тенденцию терять связь друг с другом. Происходит следующее: они мигрируют в разные стороны.

Таким образом, любая структура, которая развивается на этом ростке, имеет тенденцию к распаду. Спустя несколько дней эндотелиальные клетки подвергаются апоптозу. Следовательно, представляется, что фибробласты вырабатывают факторы, необходимые для ангиогенеза, по крайней мере, в данной системе in vitro.

Нас очень интересовало, какие именно это факторы. Мы обнаружили, что фибробласты секретируют в среду определенное вещество, поэтому мы можем использовать кондиционированную среду, полученную от фибробластов, и она будет поддерживать правильное прорастание и формирование просвета. Таким образом, мы определенно имеем дело с растворимым фактором.

Очевидно, что нам очень интересно выяснить, какие именно вещества вырабатывают фибробласты, что столь важно для ангиогенеза в данной системе. Мы проверили все наиболее вероятные варианты: VEGF и basic FGF присутствуют в культуре, и их дополнительное введение не заменяет фибробласты. Мы также пробовали ангиопоэтин-1, TGF-beta, HGF и так далее.

До настоящего момента мы не обнаружили этот жизненно важный фактор. Поэтому сейчас мы занимаемся очисткой факторов из кондиционированной среды, полученной из фибробластов. Мы пропускаем кондиционированную среду через различные колонки — катионообменные и гель-фильтрационные — и получаем фракции, обладающие соответствующей активностью.

Теперь мы отслеживаем эту активность и анализируем полученные фракции, чтобы определить, какие из них активны. Далее мы разделяем их с помощью гель-электрофореза, чтобы убедиться, что на геле осталось относительно небольшое количество полос, после чего мы вырезаем их и подвергаем секвенированию с помощью масс-спектрометрии. Это приносит нам много интересных данных. Сейчас у нас есть несколько генов-кандидатов, которые мы тестируем по отдельности, чтобы выяснить, являются ли они тем самым фактором, который мы ищем.

Мы протестировали множество известных ангиогенных факторов и установили, что VEGF и основной FGF фактически необходимы для правильного прорастания сосудов в данном анализе. Однако они составляют не всю картину. Существуют также производные факторы, которые, как я уже упоминал, играют важную роль; одним из способов изучения этого процесса стало использование опухолевых клеток, обладающих высокой ангиогенной активностью in vivo: они образуют у мышей крупные опухоли с интенсивной васкуляризацией.

Мы изучили эти опухолевые клетки и обнаружили, что они экспрессируют очень высокие уровни vegf; мы ввели их в наши культуры. Таким образом, мы заменили фибробласты этими опухолевыми клетками, и они не поддерживают активный ангиогенез в данном анализе. И это весьма интересно.

Это позволяет предположить — и это мнение разделяют и другие исследователи, — что существует перекрестное взаимодействие между опухолью, стромой (которая состоит из фибробластов и других поддерживающих клеток ткани) и эндотелиальными клетками. Вполне возможно, что опухолевые клетки вырабатывают определенные факторы, которые воздействуют непосредственно на эндотелиальные клетки, но они также вырабатывают и другие факторы, стимулирующие фибробласты и прочие клетки стромы к выработке веществ, которые в свою очередь способствуют активному ангиогенезу.