Определение Реакционная способность и титр сыворотки использованием гемагглютинации Пробирной

Определение реактивности и титра сыворотки с помощью анализа на гемагглютинацию. Глутинация представляет собой реакцию, происходящую между растворимыми антителами и particulate-антигенами. Последними могут быть клетки или частицы-носители молекул.

Эпитопы на поверхности носителя позволяют антителу связываться с ним и сшивать носители между собой, что приводит к образованию сложной решетки, называемой антиген-антителесным комплексом. Гемагглютинация представляет собой специфическую форму агглютинации, при которой антитела связываются с эритроцитами, выступающими в роли particulate-антигена. Эритроциты являются удобными мишенями, так как они легко доступны, а результаты реакции можно отчетливо наблюдать невооруженным глазом.

Образцы сыворотки подвергают серийному разведению, после чего помещают в 96-луночный планшет. Затем добавляют суспензию эритроцитов. При наличии антител в высокой концентрации происходит их связывание с эритроцитами, в результате чего образуется крупная решетка.

По мере того как эта решетка оседает под действием силы тяжести, она принимает форму лунки планшета. При взгляде сверху виден широкий слой эритроцитов. Это положительная гемагглютининовая реакция.

При низком уровне антител решетка не образуется, и эритроциты принимают форму лунки U-образной планшетки, концентрируясь на дне в виде небольшого осадка. Это отрицательная реакция гемагглютинации. На данной схеме показана положительная реакция.

При оседании клетки образуют решетку, принимая форму U-образного дна планшета. Слева и справа представлен вид сверху, где виден широкий слой эритроцитов. При наличии промежуточного количества антител будет наблюдаться образование структур в виде отдельных букв.

Гемагглютинация также позволяет проверить реактивность различных образцов сыворотки по отношению к известному антигену. Кроме того, можно определить титр образца сыворотки. Титром считается последнее разведение, при котором наблюдалась положительная реакция.

Как правило, чем выше концентрация антител в образце сыворотки, тем выше титр. На данной схеме показана отрицательная реакция гемагглютинации. Количество присутствующих антител недостаточно для образования поперечных связей между эритроцитами.

По мере того как клетки оседают под действием силы тяжести, они соскальзывают по стенке лунки, образуя плотный осадок на дне. На диаграмме справа показаны эритроциты при взгляде сверху. Для этого эксперимента вам понадобится один 96-луночный планшет с U-образным дном.

Необходимо использовать планшет с U-образным дном, так как в планшетах с плоским дном клетки не смогут осесть в виде осадка, что сделает интерпретацию результатов невозможной. С помощью дозатора в каждую лунку ряда вносят 50 µL сыворотки, 1% суспензии клеток Riva и однократный раствор фосфатно-солевого буфера verone. В лунки с 1 по 12 вносят 50 µL рояльного фосфатно-солевого буфера.

Это вещество используется в качестве разбавителя. Теперь внесите 50 µL сыворотки в лунку A1. Это будет ваше первое разведение в соотношении 1:2.

Используя перемешиватель, убедитесь, что образец сыворотки тщательно перемешан. После перемешивания перенесите 50 µL из лунки A1 в лунку A2. Это ваше второе разведение один к двум, что обеспечивает четырехкратное разведение.

Продолжите этот серийный развод в лунках с 3 по 11. Не добавляйте сыворотку в лунку 12, так как она будет служить отрицательным контролем с использованием физиологического раствора. Теперь возьмите thoroughly mixed 1% суспензию клеток Riva и перенесите по 50 µL в лунки с A1 по A12.

После добавления клеток накройте планшет крышкой и осторожно постучите по нему, чтобы обеспечить перемешивание образцов и клеток. Инкубируйте при 37 °C в течение 60 минут. Рекомендуется использовать увлажненный инкубатор.

В течение 60-минутного периода инкубации будут происходить взаимодействия антигена с антителом, и клетки начнут оседать. Видеозапись, которую вы просматриваете, представляет собой таймлапс-съемку всего 60-минутного периода. На экране показан крупный план лунок с пятой по десятую.

Мы уже рассмотрели лунку 12, которая в данном случае служила контролем с VBS. Клетки образовали плотный осадок, что указывает на правильное функционирование анализа. Лунки пять и шесть являются примерами положительной гемагглютинации.

Лунка семь представляет собой пример промежуточного результата агглютинации, в то время как лунки восемь, девять и 10 отрицательны по гемагглютинации. На основании этого результата титр определяется по разведению для лунки семь, так как это была последняя лунка, в которой наблюдалась положительная реакция.