Простая сложная система подсчета очков для оценки фенотипа мыши Модели мозжечковая атаксия
21 мая 2010 г.
Мы опишем протокол для быстрого и чувствительного количественного тяжести заболевания в мышиных моделях мозжечковая атаксия. Эти меры включают задние конечности сжимая, выступ тест, походка и кифоз. Этот протокол эффективно различает пострадавших и не пострадавших людей и определяет прогрессирование пострадавших лиц с течением времени.
Мы разработали систему оценки комбинированного фенотипа для анализа степени тяжести и прогрессирования заболевания. На моделях мышиной мозжечковой атаксии мы проводим четыре различных теста: тест на краю платформы, оценку задних конечностей (сжимание), анализ походки и оценку кифоза, используя шкалу от нуля до трех для каждого теста, что дает суммарный балл от 0 до 12. Из всех четырех показателей тест на краю платформы предназначен для прямой оценки координации.
Сжимание задних конечностей является маркером прогрессирования заболевания в ряде мышиных моделей нейродегенерации. Походка служит показателем координации и функции мышц. Кифоз представляет собой искривление позвоночника в шейно-грудном отделе, часто встречающееся у мышиных моделей нейродегенерации двигательной системы и спинномозжечкового аппарата; для каждого теста проводится оценка и фиксируется соответствующий балл.
Для каждой группы мышей рассчитывается и строится график среднего значения суммы четырех показателей или среднего композитного показателя фенотипа. При применении данного протокола к различным моделям мышей важно сначала проанализировать результаты отдельных тестов, чтобы определить оптимальную комбинацию из четырех описанных показателей. Данный конкретный протокол был разработан для дифференциации пораженных и здоровых особей, а также для количественной оценки прогрессирования фенотипа заболевания в моделях спиноцеребеллярной атаксии у мышей.
Тип семь. Здравствуйте, я Стефани Фур из лаборатории доктора Гвен Гарден с кафедры неврологии Вашингтонского университета. Сегодня мы продемонстрируем вам простой и чувствительный метод оценки степени тяжести заболевания на мышиных моделях мозжечковой атаксии.
В нашей лаборатории мы используем данную процедуру для количественной оценки фенотипических различий в мышиных моделях спиноцеребеллярной атаксии седьмого типа или SCA7, а также для отслеживания прогрессирования фенотипа SCA7 с течением времени. Итак, приступим. Тест на удержание на краю (ledge test) является прямым методом измерения координации, которая нарушается при церебеллярных атаксиях и многих других нейродегенеративных заболеваниях.
Для предотвращения систематической ошибки используются показатели, наиболее сопоставимые с признаками мозжечковой атаксии у людей. Экспериментатор, проводящий оценку, не должен знать генотип животного. В ходе оценки отдельные показатели балльно оцениваются по шкале от нуля до трех, где ноль означает отсутствие фенотипа, а три — его наиболее тяжелое проявление.
Начните с того, что поднимите мышь из клетки и поместите ее на ее край. Наблюдайте за тем, как мышь идет по краю клетки и спускается обратно в нее. Мышь дикого типа будет идти по краю, не теряя равновесия, и грациозно спустится обратно в клетку, используя лапы.
За такое поведение присваивается нулевой балл. Если мышь теряет опору при ходьбе по краю, но в остальном выглядит скоординированной, ей присваивается один балл. Если же она неэффективно использует задние конечности или не может аккуратно спуститься в клетку.
Начисляется два балла, если животное падает с выступа или почти падает при ходьбе или попытке спуститься, либо если оно дрожит и полностью отказывается двигаться. Несмотря на стимуляцию, животному начисляется три балла. Проведите тест на выступе три раза, чтобы обеспечить точность измерения, и зафиксируйте результат теста.
Теперь рассмотрим, как оценивать срастание задних конечностей. Срастание задних конечностей является маркером прогрессирования заболевания в ряде мышиных моделей нейродегенерации, включая определенные формы мозжечковых атаксий. Чтобы начать оценку, захватите хвост у основания и поднимите животное, предварительно убедившись, что вокруг нет никаких препятствий.
Наблюдайте за положением задних конечностей в течение примерно 10 секунд. Если задние конечности постоянно разведены в стороны от живота, выставляется балл ноль. Если одна задняя конечность притянута к животу более чем в 50% времени подвешивания, выставляется балл один.
Если обе задние конечности частично подогнуты к животу на протяжении более 50% времени подвешивания, выставляется балл два. Если задние конечности полностью подогнуты и касаются живота на протяжении более 50% времени подвешивания, выставляется балл три. Проведите тест трижды и зафиксируйте показатель сцепления задних конечностей.
Теперь рассмотрим, как оценивать походку. Тест на походку позволяет определить координацию и функцию мышц. Чтобы начать тест, извлеките мышь из клетки и поместите её на плоскую поверхность головой в сторону от исследователя.
Наблюдайте за мышью сзади во время ее ходьбы. Если мышь передвигается нормально, вес тела распределен равномерно на все конечности, живот не касается земли, а обе задние конечности задействованы в движении в равной степени, выставляется балл 0. Если наблюдается тремор, хромота при ходьбе или стопы слегка разведены в стороны от тела, выставляется балл 1.
Если наблюдается сильный тремор, выраженная хромота, наклон таза или если при движении стопы сильнее отклоняются от тела, назначается балл «два». Если мышь с трудом двигается вперед и волочит живот по земле, ей присваивается балл «три». Проведите оценку двигательной активности (GA) мышей трижды и зафиксируйте итоговый балл.
Теперь перейдем к делу. Тест на кифоз: кифоз представляет собой характерный изгиб позвоночника в грудном отделе. Это распространенное проявление нейродегенеративных заболеваний, затрагивающих моторные системы, включая спиноцеребеллярные атаксии на моделях мышей.
Это состояние вызвано потерей мышечного тонуса спинальных мышц вследствие нейродегенерации. Для начала извлеките мышь из клетки и поместите её на плоскую поверхность. Пронаблюдайте за её походкой.
Если мышь при ходьбе может легко выпрямить позвоночник и у нее нет стойкого кифоза, ей присваивается 0 баллов. Если у мыши наблюдается легкий кифоз, но она способна выпрямить позвоночник, ей присваивается 1 балл. Если она не может выпрямить позвоночник полностью и сохраняет стойкий, но легкий кифоз, ей присваивается 2 балла.
Если при ходьбе или в состоянии покоя у мыши сохраняется выраженный кифоз, ей присваивается балл три. Оцените степень кифоза мыши трижды. Поместите мышь обратно в клетку и зафиксируйте полученный балл кифоза.
Ниже представлен типичный график комплексной оценки фенотипа трансгенной модели спиноцеребеллярной атаксии 7-го типа, известной как Flocked SCA 7 92 Q. Для каждой мыши суммировались показатели четырех параметров, после чего рассчитывался средний совокупный балл для каждого генотипа в зависимости от возраста. Мыши Flocked SCA 7 92 Q демонстрируют прогрессирующий фенотип SCA7, который существенно отличается от показателей нетрансгенных однопометников. Важно отметить, что постепенное увеличение этого показателя фенотипа с течением времени соответствует прогрессирующему характеру заболевания у людей.
Мы только что продемонстрировали, как использовать систему комплексной оценки фенотипа для анализа степени тяжести и прогрессирования заболевания на мышиных моделях мозжечковой атаксии. При выполнении данной процедуры важно помнить, что ожирение является смешивающим фактором во всех четырех описанных тестах. Результаты отдельных тестов можно анализировать раздельно, чтобы сначала определить их оптимальную комбинацию в системе комплексной оценки фенотипа, наиболее подходящую для вашей модели мыши.
На этом всё. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлен протокол количественной оценки степени тяжести заболевания на моделях мозжечковой атаксии у мышей. Оценка включает тесты на сжимание задних конечностей, способность удерживаться на выступе, анализ походки и кифоза, что позволяет эффективно дифференцировать больных и здоровых особей, а также отслеживать прогрессирование заболевания.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Поведенческая оценка
- Мышиные модели заболеваний
Теоретические сведения
- Мозжечковая атаксия характеризуется нарушениями координации и равновесия.
- Мышиные модели часто используются для изучения нейродегенеративных заболеваний.
- Системы оценки фенотипа помогают в определении степени тяжести заболевания.
- Комплекс тестов обеспечивает всестороннюю оценку моторной функции.
Цель исследования
- Разработать надежную систему оценки для определения степени тяжести заболевания.
- Отслеживать прогрессирование симптомов на мышиных моделях.
- Дифференцировать пораженных особей от непораженных.
Используемые методы
- Система оценки совокупного фенотипа со шкалой от 0 до 3 для каждого теста.
- Четыре теста: тест на удержание за край (ledge test), спастическое сжимание задних конечностей, оценка походки и измерение кифоза.
- Результат каждого теста суммируется в общий балл в диапазоне от 0 до 12.
- Прямая оценка координации и функции мышц с помощью данных тестов.
Основные результаты
- Тест на удерживание за край позволяет эффективно оценить координацию.
- Прижимание задних конечностей указывает на прогрессирование заболевания.
- Анализ походки отражает состояние координации и функций мышц.
- Кифоз наблюдается в моделях дегенерации моторной системы.
Выводы
- Данный протокол обеспечивает чувствительную оценку степени тяжести заболевания.
- Он позволяет отслеживать прогрессирование заболевания с течением времени.
- Эта система оценки может углубить понимание мозжечковой атаксии в рамках исследований.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Данный протокол представляет собой количественную, воспроизводимую основу для оценки нейродегенеративных фенотипов в доклинических моделях, что способствует валидации мишеней и снижению механистических рисков в исследованиях мозжечковой атаксии. Позволяя дифференцировать пораженных и здоровых особей, а также отслеживать временную прогрессию, этот метод повышает прогностическую достоверность в рабочих процессах раннего поиска. Подход с использованием композитной оценки увеличивает статистическую мощность и трансляционную преемственность при отборе портфеля препаратов и идентификации ведущих соединений.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы посредством количественной оценки моторного фенотипа.
- Практическая ценность: способствует снижению биологических рисков за счет обеспечения объективной слепой оценки степени тяжести заболевания.
- Научная ценность: облегчает уточнение сигнальных путей путем корреляции суммарных баллов с генетическими или фармакологическими воздействиями.
Скрининг и разработка методов анализа
- Научная ценность: Обеспечивает стандартизированные количественные показатели (по шкале от 0 до 12) для скрининга соединений в моделях атаксии.
- Практическая ценность: Гарантирует воспроизводимость анализа за счет проведения тестов в трех повторностях и слепой оценки по каждому параметру.
- Научная ценность: Позволяет проводить надежную оценку соединений, дифференцируя фенотипическое восстановление от базовой вариабельности.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Соответствует системам, релевантным заболеванию, путем моделирования фенотипов прогрессирующей мозжечковой атаксии.
- Операционная ценность: Обеспечивает согласование трансляционных биомаркеров посредством лонгитюдного отслеживания изменений совокупного балла.
- Научная ценность: Обосновывает решения о переходе к следующим этапам разработки с учетом рисков путем количественной оценки степени тяжести фенотипа и скорости прогрессирования.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод интегрируется в рабочие процессы раннего поиска для проверки гипотез и снижения биологических рисков до этапов идентификации соединений-лидеров.
- Открывающая биология: способствует снижению механистических рисков путем количественной оценки фенотипов координации, захвата, походки и искривления позвоночника.
- Скрининг: обеспечивает стандартизированные результаты, готовые к анализу, с определенными порогами оценки для обнаружения эффектов соединений.
- Аналитика: формирует совокупные и индивидуальные тестовые баллы, позволяющие проводить статистическое сравнение между группами терапии.
- Трансляционные исследования: обеспечивают преемственность с доклиническим этапом посредством прогрессивного моделирования фенотипа у мышей с SCA7.
- Корпоративное повторное использование: создает многоразовую платформу для фенотипирования, применимую к различным моделям мозжечковой атаксии.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: Повышает прогностическую достоверность за счет снижения фенотипической неоднозначности в моделях нейродегенерации.
- Операционная ценность: Повышает уровень стандартизации и воспроизводимости благодаря слепому методу оценки в трех повторностях.
- Стратегическая ценность: Оптимизирует принятие решений о продолжении или прекращении исследований (go/no-go) за счет обеспечения объективной стратификации степени тяжести.
- Влияние на портфель: Обеспечивает приоритизацию с учетом рисков благодаря количественным показателям прогрессирования заболевания.
Особенности реализации
- Требуются экспертные знания в области поведенческой нейробиологии и навыки работы с мышами для точной оценки фенотипа.
- Зависимость от стандартизированной среды тестирования и последовательного обучения наблюдателей для минимизации вариабельности.
- Необходима межкомандная стандартизация критериев оценки для обеспечения воспроизводимости в нескольких центрах.
- Требуется адаптация при применении весовых коэффициентов совокупного балла к различным моделям атаксии.
- Учитывается практическое ограничение в виде ожирения как вмешивающегося фактора, требующего фенотипической нормализации.
