Первичные человеческие бронхиальные эпителиальные клетки, выращенных из эксплантов

В данной статье мы описываем протокол культивирования и экспансии эпителиальных клеток бронхов человека, полученных из свежеизолированных сегментов бронхов человека. Этот протокол состоит из пяти разделов: кодирование и скарификация, использование 100-мм культуральных планшетов, подготовка ткани бронхов, эксплантация трансплантатов ткани бронхов, пассирование реснитчатых эпителиальных клеток бронхов человека, культивирование эпителиальных клеток бронхов человека на трансвеллах. Перед началом работы обратите внимание, что все этапы проводятся в боксе биологической безопасности.

Если не указано иное, пожалуйста, ознакомьтесь с разделом «Материалы, реагенты и подготовка» и убедитесь, что вы подготовили всё необходимое. Следующие этапы: кодирование, подготовка сток-растворов, культивирование, приготовление сред, растворов для диссоциации, покрытие и создание царапин, а также подготовка культуральных чашек диаметром 100 мм должны быть выполнены заранее.

Соблюдайте полную стерильность. Подготовьте стерильные культуральные чашки диаметром 100 мм и раствор для покрытия. С помощью пипетки перенесите 2 мл раствора для покрытия в чашку диаметром 100 мм и аккуратно перемешайте содержимое круговыми движениями, чтобы равномерно покрыть дно чашки.

Убедитесь, что раствор для покрытия равномерно покрывает дно планшета. Пипеткой удалите остатки раствора и используйте их для покрытия второго планшета диаметром 100 мм. Повторите процедуру для всех необходимых планшетов.

Количество необходимых планшетов зависит от числа эксплантов ткани. Убедитесь, что раствор для покрытия равномерно покрывает дно планшетов, как показано на видео.

Накройте планшеты крышками. Оставьте планшеты высыхать в инкубаторе на один-два часа и перед использованием для эксплантации бронхиальной ткани аспирируйте избыток раствора. Неиспользованные покрытые культуральные планшеты можно поместить в стерильный пакет и хранить при температуре 4 °C для последующего использования.

Продезинфицируйте с помощью спрея маленькие острые ножницы, скальпель и пинцет 70% ethanol, затем поместите в BSC пластины с нанесенными царапинами, с силой нажимая скальпелем для формирования глубоких небольших XS (не менее четырех на пластину). Если царапина будет недостаточно глубокой, кусочки ткани не закрепятся и будут плавать. Вне BSC поместите ткань в чашку P three. Тщательно промойте изолированную ткань бронхов человека в Bss out.

Раскройте фрагменты бронхов. Перенесите ткань в BS, а затем в стерильный 100-мм планшет для культивирования тканей с охлажденным DMEM/F-12, содержащим 1% антибиотика-антимикотика. С помощью острых маленьких ножниц разрежьте ткань на кубики размером 2–3 мм.

С помощью пинцета поместите по одному кусочку разрезанной ткани в центр каждого X и прижмите. Осторожно дайте кусочкам ткани или эксплантам X прикрепиться к планшету в течение нескольких секунд. Затем аккуратно добавьте 10 мл полной среды. Если после добавления среды ткань всплывает, с помощью пинцета вдавите ее в бороздки X или сделайте новый X. Может потребоваться создание новых X, если бороздки недостаточно глубокие.

Поместите планшеты в инкубатор и меняйте среду каждые три-четыре дня до тех пор, пока ткани не будут готовы к трансплантации. Это занимает примерно четыре недели, пока вокруг тканей не вырастет достаточное количество эпителиальных клеток, чтобы покрыть области размером один-два сантиметра. Используйте 100-мм планшеты с покрытием и предварительным нанесением царапин.

Поскольку эксплантаты тканей могут прижиться не во всех случаях, количество планшетов зависит от числа пересаживаемых фрагментов ткани. Если используются планшеты, которые были предварительно покрыты и хранились при температуре 4 °C, перед использованием их следует довести до комнатной температуры. С помощью пинцета осторожно перенесите ткань из исходного планшета, поместите ее в центр новой лунки и слегка прижмите. Ткани без признаков роста следует утилизировать.

Дайте ткани прикрепиться к планшету. В течение нескольких секунд добавьте среду и инкубируйте. Добавьте то, что было описано ранее для X explan.

Таким образом, на каждую 100-мм чашку для культивирования тканей требуется 2 мл стокового раствора трипсина и EDTA. Разведите стоковый раствор 6 мл стерильного 0,01 M PBS; при добавлении 2 мл стокового раствора к 6 мл PBS конечная концентрация трипсина составит 250 µg/ml, а EDTA — 100 µg/ml. После переноса эксплантов на новую чашку аспирируйте среду из чашек, содержащих клеточные кольца диаметром 1–2 см.

Добавьте по 8 мл теплого разведенного раствора капель и EDT в каждую 100-мм чашку. Поместите в инкубатор при 37 °C на 3–15 минут. Регулярно проверяйте результат.

Слишком длительное воздействие трипсина приведет к повреждению клеток. Проверяйте планшеты под микроскопом, чтобы убедиться, что большинство клеток открепились; клетки округлятся и отделятся, как показано на восьмикратном увеличении. Добавьте в каждую лунку среды с 10% FBS для инактивации раствора ЭДТА.

Объедините содержимое всех планшетов в одну пробирку или в отдельные пробирки для разных типов тканей. Подсчитайте количество клеток с помощью гемоцитометра. Центрифугируйте при 100 g в течение пяти минут. На дне пробирки образуется осадок клеток; ресуспендируйте клеточный осадок в полной среде до достижения желаемой концентрации клеток.

Поместите от 2 до 3 миллионов клеток в каждый флакон T 75 и добавьте полное питательное среду в необходимом объеме. Инкубируйте и замените среду. Каждые три-четыре недели клетки в флаконах D 75 вырастают до субконфлюэнтного состояния.

Примерно через четыре недели клетки следует снять и экспандировать или использовать при субконфлюэнтном состоянии, чтобы предотвратить старение. Начните с подготовки проницаемых мембран трансвеллов. Используйте вставки диаметром 6.5 millimeter, которые подходят для многолуночных планшетов на 24 лунки.

Добавьте среду с обеих сторон мембраны. 600 мкл снизу и 0,1 мл сверху. Инкубируйте в течение одного часа в инкубаторе для культур клеток.

Осторожно удалите среду с обеих сторон мембраны. Начинайте с базального объема; будьте предельно аккуратны, так как мембрана может быть легко повреждена. Поэтому отбирайте среду пипеткой, прижав ее к стенке культурального вкладыша, используя рекомендуемый объем.

Несоблюдение этого правила приведет к переливанию среды в соседние лунки с посеянными клетками. После преинкубации проницаемой подложки осторожно внесите суспензию клеток пипеткой на апикальную сторону мембраны: для лунок диаметром 6,5 мм добавьте 0,1 мл суспензии клеток на апикальную сторону мембраны. Внесите пипеткой 0,6 мл среды на базальную сторону мембраны.

Обеспечивайте питание клеток с апикальной и базальной сторон в течение 10 дней. Для создания хорошо дифференцированной культуры заменяйте среду дважды в неделю. Удаляйте базальный объем, используя продемонстрированный метод.

Сначала замените эпикальное volume: добавьте 0,6 мл среды на базальную сторону мембраны. Этот метод способствует прикреплению клеток к мембране и предотвращает их длительный контакт с воздухом. Быстро замените среду и верните образец в инкубатор.

На 10-й день создайте границу раздела воздух-жидкость, удалив среду AAL и заменив 0,6 мл среды с базальной стороны мембраны. Содержите клетки в условиях границы раздела воздух-жидкость в течение шести недель, меняя среду дважды в неделю. Реснитчатые клетки начнут появляться через четыре недели после создания границы раздела.

Жидкий интерфейс. Клетки достигнут равномерной дифференцировки в реснитчатые клетки. Спустя шесть недель после создания жидкого интерфейса уха.

Сегменты бронхов человека со здоровыми эпителиальными клетками, полученные из эксплантатов и трансплантатов. В нашем исследовании успешное культивирование эксплантатов бронхиальной ткани было достигнуто в восьми из девяти образцов. Поскольку одна из культур эксплантатов была инфицирована, кольца эпителиальных клеток достигли радиуса от 1 до 2 см в течение трех-четырех недель.

Успешные эксплантаты X культивировали повторно до шести раз. Во всех успешных культурах наблюдалась миграция клеток в течение 48 часов после начала трансплантации, либо эксплантаты X приобретали характерный для этих эпителиальных клеток вид «булыжной мостовой», как показано на панели B. На данной и последующих фигурах иммуноокрашивание цитологических препаратов клеток из эксплантатов и клеток, высеянных на покровные стекла, показало, что все клетки были положительны по специфическому для эпителия цитокератину; здесь представлены человеческие субкультуры бронхиальных клеток, выращенные до субконфлюэнтного состояния в колбах T 75. Обратите внимание на вид «булыжной мостовой».

Субкультуры бронхиальных клеток человека показали равномерное положительное иммуноокрашивание на кератин и E.cad. Иммуноокрашивание со специфическими антителами к другим типам клеток не выявило признаков контаминации культур фибробластами, мезенхимальными или эндотелиальными клетками. Для получения более подробной информации, пожалуйста, обратитесь к рисунку 5 и подписи к нему в тексте. Клетки, культивируемые на проницаемых полиэстеровых мембранах или трансвеллах с жидким интерфейсом, дифференцировались в реснитчатый эпителий, как показано здесь; следует утилизировать клетки и их трансплантаты, если начинают появляться клетки с иной морфологией, чем продемонстрировано здесь. В данном протоколе мы представили детальные методы культивирования и экспансии первичных бронхиальных эпителиальных клеток человека.

Исследования на основе человеческих клеток необходимы для определения важных путей механизмов заболеваний легких человека, а также для токсикологического и фармакологического скрининга новых лекарственных препаратов. Мы надеемся, что описанные здесь методы побудят вас культивировать эпителиальные клетки бронхов человека из эксплантатов и использовать эти клетки в ваших системах исследования. Благодарим вас и желаем удачи.