Анализ развития Морфологические Фенотип как функция концентрации белка в почкующихся дрожжей

В данном протоколе используется регулируемый промотор, который позволяет контролировать экспрессию белка. В этом эксперименте мы используем высококопийную плазмиду 2 микрон, которая экспрессирует N-концевой двухдоменный фрагмент под управлением метионин-репрессируемого промотора. С помощью этой плазмиды трансформируют дрожжевые клетки дикого типа.

Плазмиды и трансформанты отбирают на чашках без uol. После ночного роста в селективной среде клетки синхронизируют путем остановки роста, опосредованной отсутствием кортизола.

Наконец, экспрессия индуцируется путем переноса клеток в среду, не содержащую метионин, в ходе временного эксперимента. Концентрация белка контролируется с помощью вестерн-блоттинга, а развитие морфологического фенотипа — с помощью микроскопии. Здравствуйте, я Клаудия из департамента биологических наук Университета Пердью.

Я — де Бари Муджи из лаборатории alar и AL. Сегодня мы продемонстрируем процедуру анализа развития морфологического фенотипа в зависимости от концентрации белка в индуцированном теле. Мы используем эту процедуру в нашей лаборатории для изучения морфологических и молекулярных аспектов фенотипа клеточного деления, наблюдаемого при сверхэкспрессии N2-домена эндоцитозного адаптерного белка absent two.

Итак, приступим. Данный протокол начинается с конструирования штамма дрожжей, который будет экспрессировать интересующий вас белок. В нашем случае мы трансформировали дикий штамм дрожжей W 3 0 3 плазмидной ДНК с высоким числом копий, содержащей nth two под контролем репрессируемого метионином промотора; 2 millimolar methionine подавляет активность промотора met 25.

Хотя среда, не содержащая метионина, обеспечивает максимальный уровень экспрессии, выберите шесть колоний с чашки с недавно трансформированными клетками и инокулируйте их в 50 миллилитров селективной среды с 0.2 millimolar метионина в конической колбе; инкубируйте в течение ночи при 30 degrees Celsius с перемешиванием при 200 RPM. На следующее утро оцените плотность клеток, измерив оптическую плотность культуры при 600 nanometers. Перенесите эквивалент 20 OD 600 nanometers на миллилитр клеток в стерильную центрифужную пробирку и осадите путем центрифугирования.

Ресуспендируйте клетки в среде YPD, используя вортекс, для синхронизации клеточного цикла до конечной концентрации 15 µg/mL из стокового раствора 1 mg/mL в DMSO. Инкубируйте в течение четырех часов при 30 °C с перемешиванием при 200 RPM. Через четыре часа определите процент клеток, остановившихся в митозе.

Осмотрите препарат под микроскопом и подсчитайте количество клеток с почками равного размера, затем переходите к следующему шагу. Только в том случае, если уровень остановки клеточного цикла превышает 90%, соберите клетки путем центрифугирования при 2200 RPM в течение пяти минут. После трехкратной промывки ледяной водой ресуспендируйте осадок в селективной среде без метионина до плотности клеток примерно 0.5 OD 600 nanometers на миллилитр.

Перенесите половину объема суспензии клеток в новую стерильную пробирку и добавьте метионин до конечной концентрации 0.2 millimolar. Данный образец будет служить контролем для оценки эффектов, обусловленных базальным уровнем экспрессии белка. Верните обе культуры в инкубатор при температуре 30 degree Celsius.

Анализ развития фенотипа клеток проводят каждый час в течение шести часов для каждой временной точки. Перенесите 1 мл клеточной суспензии каждой культуры в стерильную микроцентрифужную пробирку и осадите клетки центрифугированием, аспирируйте супернатант и ресуспендируйте осадок в 70 µL среды. Затем добавьте 30 µL метиленового синего из стокового раствора с концентрацией 1 mg/mL в стерильной воде.

Затем пипеткой нанесите около 6 µL данной суспензии на чистый предметное стекло и накройте каплю покровным стеклом. Осторожно нажмите на покровное стекло, чтобы сформировать тонкий равномерный слой клеток между стеклянными поверхностями. Разделите область под покровным стеклом на девять квадрантов и сделайте по три снимка в каждом квадранте.

Количество клеток в одном поле зрения не должно превышать 30 клеток для обеспечения точного количественного анализа. Подсчитайте количество клеток, проявляющих изучаемый фенотип, который в данном примере представлен почкующимися клетками дрожжей с удлиненными и/или конкатенированными почками, которые не отделяются друг от друга. Мы также подсчитываем количество мертвых клеток, определяемых по их синему цвету, так как дефект деления клеток индуцируется при nth.

Двойная сверхэкспрессия приводит к гибели клеток, что позволяет визуализировать специфические фенотипические дефекты в каждый момент времени. Перенесите аликвоту в 1 мл культуры в стерильную микроцентрифужную пробирку и соберите клетки путем центрифугирования. Ресуспендируйте клеточный осадок в 100 мкл раствора Calwhite в стерильной воде с концентрацией 1 мг/мл и инкубируйте в течение пяти минут при комнатной температуре в темноте.

Окрашивание кальциевым белым позволяет визуализировать клеточную стенку. Промойте осадок трижды 1×PBS. Взвесьте полученный осадок в 100 µL PBS.

Рассмотрите клетки под микроскопом и получите изображения при 100-кратном увеличении, используя УФ-оптику для визуализации клеточной стенки. Для визуализации септина с GFP-меткой получите изображения с помощью фильтра FS E. Определите процент клеток с дефектами клеточной стенки и неправильной локализацией септина методом, описанным ранее: разделите покровное стекло на девять квадрантов и сделайте по три снимка в каждом квадранте для подсчета. Для записи видео таймлапса микроскопия одиночных дрожжевых клеток требует использования агарозных подушек, погруженных в среду; для создания агарозной подушки следуйте инструкции.

Сначала очистите предметное стекло с вогнутым углублением 70% спиртом и дайте ему высохнуть на воздухе. В это время прокипятите 0,06 г агарозы в пяти миллилитрах селективной среды без метионина в микроволновой печи до полного и быстрого растворения агарозы. Пипеткой перенесите 200 мкл среды с агарозой на предметное стекло.

Выемка, и накройте её другим чистым предметным стеклом, стараясь не допустить образования пузырьков воздуха под ним. После затвердевания геля плавно сдвиньте верхнее стекло с одного края выемки, постоянно удерживая поверхности стекол параллельно друг другу. Это обеспечит ровную поверхность слоя агарозы, совпадающую с поверхностью стекла с выемкой.

Очистите область предметного стекла вокруг агарозного слоя с помощью мягкой салфетки. Теперь предметное стекло готово к использованию по истечении четырех часов. Перенесите один миллилитр клеток из культуры в стерильную микроцентрифужную пробирку и осадите путем центрифугирования.

Отоберите супернатант и ресуспендируйте клетки в 100 мкл свежей селективной среды без метионина. Нанесите вазелин по краям покровного стекла. Затем поместите каплю клеточной суспензии в центр слоя агарозы и равномерно распределите ее, осторожно прижимая сверху покровное стекло.

Герметизируйте края покровного стекла и зафиксируйте его положение, покрыв края лаком для ногтей. После высыхания лака поместите предметное стекло на подогреваемый предметный столик микроскопа. Мы используем микроскоп Zeiss Axio 200 M, оснащенный монохромной цифровой камерой Zeiss Axio camm, MRM, чтобы выбрать поле зрения, содержащее не более 10 достаточно удаленных друг от друга клеток, так как со временем плотность клеток в поле будет увеличиваться.

По мере деления клеток делайте снимки поля зрения каждые пять минут в течение примерно пяти часов. Чтобы избежать многократной повторной настройки фокуса, мы программируем программное обеспечение для сбора данных так, чтобы оно автоматически получало несколько Z-стековых изображений в каждой временной точке.

Для сборки видеозаписи позже будет выбрано изображение с наилучшей фокусировкой. Чтобы обеспечить клеткам достаточный уровень тепла, в дополнение к подогреваемым предметным столикам в качестве внешнего источника тепла на протяжении всего процесса визуализации будет оставлен включенным transmitted white light микроскопа. Регрессия фенотипа может быть изучена путем объединения изображений в видео с помощью программного обеспечения Image J. Здесь представлены репрезентативные результаты гиперэкспрессии нашего целевого белка. Nth two.

Сначала была определена экспрессия белка nth two. В ходе временного ряда эксперимента лизаты клеток, экспрессирующих HA nth two, анализировали методом вестерн-блоттинга с использованием моноклонального антитела к HA. Как показано на иммуноблоттинге, в клетках, выращенных в присутствии 0,2 мM метионина, наблюдается минимальная экспрессия белка. Однако в клетках, выращенных в среде без метионина, отмечается устойчивый рост концентрации S two в течение всего эксперимента.

Затем были проанализированы клетки, выращенные в присутствии или отсутствие метионина в течение шести часов, поскольку низкая концентрация nth two не способна вызвать фенотип деления клеток или только гибель клеток. Небольшой процент клеток погиб, что indicated их синим цветом после окрашивания метиленовым синим. Аналогично, количество ядер на клетку, организация клеточной стенки и септинов в норме, как и ожидалось.

Напротив, гиперэкспрессия M two приводит к массивному дефекту деления клеток и гибели клеток, что проявляется в виде длинных цепочек соединенных удлиненных почек, которые сохраняют синий цвет при окрашивании метиленовым синим. Большинство фенотипических клеток являются многоядерными, о чем свидетельствует окрашивание DPI. Окрашивание Calcofluor white демонстрирует накопление аномальных участков клеточной стенки.

Кроме того, септин грубо неправильно локализован и дезорганизован. Количественная оценка фенотипа в зависимости от времени представлена на данном графике, где незакрашенные кружки соответствуют 0 мM метионина, а закрашенные кружки — 0.2 мM метионина. Мы видим, что по мере накопления концентрации nth two в клетках с течением времени процент клеток с фенотипом деления также увеличивается.

Контрольные клетки, выращенные при 0.2. Milli methionine, показывают, что развитие фенотипа зависит от повышенной концентрации белка, а не от условий культивирования клеток. Наконец, развитие фенотипа при сверхэкспрессии nth two зафиксировано с помощью видеомикроскопии с записью временных интервалов.

Спустя четыре часа после nth две клетки с гиперэкспрессией демонстрируют легкий морфологический фенотип нарушения деления клеток. По мере развития видеозаписи наблюдаются аномальные и продолжительные периоды роста апикальной почки, что приводит к образованию сильно вытянутых почек. Также зафиксированы случаи появления новых почек до того, как произошло разделение клеток.

Кроме того, наблюдается появление почек в нескольких областях клетки материнского организма, что приводит к возникновению ветвления. Мы только что продемонстрировали, как характеризовать и анализировать развитие морфологического фенотипа в зависимости от концентрации белка при почковании. При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости осаждения клеток при рекомендуемых скоростях центрифугирования, так как более высокие скорости могут повредить клетки.

Также важно помнить о необходимости добавления метиленового синего и хлорида непосредственно перед визуализацией, так как они токсичны для клеток светящегося востока. Благодарим за просмотр и желаем удачи в ваших экспериментах.