ДНК-идентификация видов рыб протокола

Система идентификации видов рыб представляет собой простой, быстрый и точный метод на основе анализа ДНК для определения видов рыб, присутствующих в данном образце. Образцы рыб обрабатывают протеиназой K для высвобождения нуклеиновых кислот в раствор. Затем изолируют геномную ДНК рыб и амплифицируют её с помощью ПЦР, используя праймеры, которые связываются с последовательностями, присутствующими во всех геномах рыб.

Затем продукты ПЦР переваривают тремя различными рестрикционными эндонуклеазами и разделяют на биоанализаторе Agilent 2100. Длина фрагментов, полученных в результате реакций рестрикции, может быть использована для определения вида рыб с помощью анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов или программного обеспечения для сопоставления паттернов RFLP. Здравствуйте, я Рэйчел Формоза из Agilent Technologies.

Сегодня мы продемонстрируем процедуру идентификации видов рыб на основе анализа ДНК. Этот метод скрининга позволяет определить виды рыб, присутствующие в свежих, замороженных, измельченных, вареных, сушеных или иных переработанных образцах. Данная процедура может быть выполнена менее чем за один рабочий день.

Данная процедура используется нами для изучения подлинности морепродуктов, что крайне важно для данной отрасли, поскольку замена одного вида другим и неправильная маркировка могут иметь серьезные экономические, экологические последствия, а также влиять на безопасность пищевых продуктов. Кроме того, определение вида рыбы путем визуального осмотра и других традиционных методов может быть особенно затруднительным. После переработки рыбы анализ ДНК обеспечивает гораздо более точный и надежный результат.

Итак, приступим. Начните подготовку образцов к экстракции ДНК, поместив от 10 до 1000 мг каждого образца сырой или приготовленной ткани рыбы в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл для каждой рыбы. Добавьте 220 мкл свежеприготовленного раствора протеиназы К и перемешайте путем пипетирования.

Инкубируйте пробирки при 65 °C в течение 10 минут, после чего центрифугируйте от 3 до 5 минут при 14 000 G для осаждения любых непереваренных тканей. Затем осторожно перенесите 150 µL каждого супернатанта в новую пробирку объемом 1,5 мл, избегая попадания непереваренного материала со дна и маслянистого слоя сверху. Полученный супернатант будет использован для экстракции геномной ДНК.

Начните экстракцию геномной ДНК, добавив 500 µL буфера для связывания нуклеиновых кислот в каждый образец. Таким образом, общий объем образца составит 650 µL. Перемешайте образец на вортексе до достижения гомогенности.

Затем перенесите каждый образец в центрифужную колонку для связывания ДНК, установленную в одну из двухмиллилитровых пробирок, входящих в состав набора. Плотно закройте пробирку крышкой. Центрифугируйте образцы в течение одной минуты при 14 000 G, чтобы нанести ДНК на матрицу колонки.

После центрифугирования извлеките центрифужные стаканчики, слейте фильтрат и поместите стаканчики обратно в приемные пробирки. Добавьте 500 µL 1x промывочного буфера с высокой концентрацией соли. Закройте пробирки крышками и повторно центрифугируйте после завершения центрифугирования.

Удалите фильтрат и снова поместите центрифужные стаканчики в приемные пробирки. Теперь добавьте 500 µL 80% этанола. Закройте пробирку крышкой и центрифугируйте при 14 000 G в течение одной минуты.

Повторите промывку этанолом еще два раза после третьей промывки в 80% этаноле, фильтраты удалите. Поместите центрифужные стаканчики обратно в приемные пробирки и на этот раз центрифугируйте в течение двух минут для высушивания волокнистого матрикса. Затем перенесите центрифужные стаканчики в коллекционные пробирки объемом 1,5 миллилитра.

Добавьте 100 µL элюирующего буфера в каждый спин-центрифужный стаканчик непосредственно на волоконную матрицу внутри стаканчика. Затем плотно закройте стаканчики крышками collect-пробирок и инкубируйте их при комнатной температуре в течение одной минуты. После инкубации центрифугируйте образцы на максимальной скорости в течение одной минуты.

Затем удалите центрифужный стакан и закройте пробирки крышками. При измерении концентрации ДНК ожидаются значения в диапазоне от 5 нг/мкл до 500 нг/мкл. ДНК можно хранить при температуре 4 °C до одного месяца; для длительного хранения поместите ДНК при температуре -20 или -80 °C.

Проведите ПЦР, используя праймеры и реагенты из набора P-C-R-R-F-L-P. Согласно прилагаемому письменному протоколу, рекомендуется проводить анализ каждого образца, включая положительный контроль и контроль без матрицы, в двух повторностях в процессе ПЦР. Подготовьте мастер-миксы с рестрикционными эндонуклеазами для переваривания DTE E one, HAE three и NL three, последовательно смешивая следующие компоненты: 1.5 µL стерильной дистиллированной воды, 0.5 µL 10x буфера для фермента и 0.5 µL 10x фермента.

Приготовьте смесь реагентов fourex three в объеме, достаточном для всех образцов, плюс один дополнительный объем реакции. Затем распределите по 2,5 µL в каждую пробирку для реакции, помеченную названием образца и фермента. По завершении ПЦР извлеките образцы из амплификатора и поместите их на лед.

Добавьте по 2,5 µL каждого ПЦР-продукта в каждую из трех пробирок для рестрикционного переваривания для данной реакции: DDE 1, HAE 3 и NLA 3. Затем перемешайте на вортексе.

Кратковременно центрифугируйте и инкубируйте смеси для переваривания при 37 °C в течение двух часов. При необходимости инкубацию можно проводить в течение ночи. После завершения переваривания инкубируйте реакции при 65 °C в течение 15 минут.

Затем добавьте в каждую пробирку 1 µL 60 мM ЭДТА для остановки реакции и перемешайте на вортексе. Используя набор реагентов для биоанализатора Agilent, подготовьте и внесите продукты рестрикции в лунки чипа A DNA в соответствии с руководством к набору. Для каждого образца все три продукта рестрикции должны быть нанесены на один и тот же чип.

Затем перемешайте чип на вортексе и установите его в прибор. После завершения анализа перейдите в контекст анализа и выберите вкладку «Сводка по чипу» (chip summary). В поле «Название образца» (sample name) введите название образца для всех 12 лунок чипа, чтобы идентифицировать виды рыб для исследуемых образцов ДНК.

Запустите программу декодера RFLP, нажав кнопку «File» (Файл). Затем откройте файл XAD. Появится диалоговое окно открытия файла.

Теперь выберите XAD-файл для использованного ДНК-чипа. Нажмите «Открыть», чтобы увидеть список образцов, нанесенных на чип. Выберите три перевари (дигеста), соответствующие первому образцу ДНК.

В столбце enzyme укажите рестрикционные ферменты, которые были использованы в поле с меткой min peak height as percent of lower marker. Значение по умолчанию составляет 10%. При необходимости это значение можно уменьшить, чтобы выявить пропущенные малые пики, или увеличить, чтобы отсечь пики, возникшие вследствие неспецифического шума на электрофореграмме.

После внесения любых корректировок в значение минимальной высоты пика (min peak height) нажмите «reintegrate». Затем нажмите «calc» в нижней части диалогового окна. Данные о длине фрагмента, полученные в результате анализа на биоанализаторе, будут автоматически внесены в поля программного обеспечения.

Затем в выпадающем списке показателей в верхнем левом углу экрана выберите dice. Если образец рыбы состоит из одного вида или смеси (в случае, если образец может быть смесью), обратите внимание на таблицу в нижней части экрана под названием combined score list. В ней представлены наилучшие совпадения по видам на основании результатов всех трех реакций переваривания.

Полные совпадения с баллом один выделены зеленым цветом. Приблизительные совпадения выделены желтым цветом в верхней части экрана. Нижнее пороговое значение определяет минимальный размер фрагмента, используемый в анализе, а значение допуска совпадения определяет, насколько близким по длине должен быть фрагмент к прогнозируемому фрагменту, чтобы считаться совпадением.

Указанные значения являются настройками по умолчанию и могут быть изменены. Повторите эти шаги для анализа остальных образцов ДНК на наконечнике. Образцы ДНК четырех различных видов рыб были выделены, амплифицированы и подвергнуты рестрикции с использованием метода, описанного в данном видео.

Здесь представлен гель биоанализатора с образцами после рестрикционного анализа, полученный с помощью Agilent Bioanalyzer и декодера ПДРФ (RFLP). Для идентификации рыб используются программные паттерны полос. Первый образец правильно идентифицирован как форель, второй — как тунец, третий — как морской окунь.

И последний образец в качестве специфического кода. Мы только что продемонстрировали вам, как проводить идентификацию видов рыб на основе анализа ДНК с использованием метода ПЦР-РФЛП от компании Agilent. При выполнении этой процедуры крайне важно избегать перекрестного загрязнения образцов, так как данный метод обладает высокой чувствительностью.

На этом всё. Теперь вы знаете, как быстро, легко и точно определить виды рыб в ваших образцах. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.