Оптическая микроскопия Scatter на основе двумерных фильтров Габора

В данном видео используется метод микроскопии оптического рассеяния для количественной оценки фрагментации митохондрий при апоптозе. Хотя в данном протоколе микроскопия оптического рассеяния обычно не требует флуоресценции, флуоресцентные изображения будут получены для целей валидации. После настройки системы визуализации клетки окрашиваются красителем MIT tracker green и обрабатываются сторпорином для индуцирования апоптоза.

Оптические данные собираются для обнаружения изменений в ориентации клеточных органелл в течение двух часов. Начало фрагментации митохондрий можно измерить с помощью данных о рассеянии света, которые демонстрируют снижение степени ориентации субклеточных частиц. Затем данные подтверждаются путем корреляции данных о рассеянии света с флуоресцентными областями, содержащими митохондрии.

Здравствуйте, я Нада Бустани из Лаборатории биооптики кафедры биомедицинской инженерии Университета Ратгерса. Я Роб Пак из Лаборатории биооптики, а я Дин, также из этой лаборатории. Сегодня мы продемонстрируем вам процедуру количественного анализа динамики субклеточной морфологии с использованием метода, который не опирается на флуоресцентные красители.

Мы используем этот метод в нашей лаборатории для изучения динамических изменений субклеточной структуры в процессе апоптоза или программируемой гибели клеток. Итак, приступим. Начните выполнение процедуры со стерилизации рук в перчатках 70% ethanol.

Затем поместите подготовленный стоковый раствор miot tracker green в концентрации 100 nano molar и предварительно нагретую среду для культивирования клеток BAEC в вытяжной шкаф с выключенным светом и простерилизуйте все поверхности. Далее поместите в шкаф шестилуночный культуральный планшет с клетками, высеянными на покровные стекла. Используйте пастежную пипетку, подключенную к вакуумной линии.

Удалите культуральную среду из лунок. Затем для маркировки митохондрий клеток немедленно добавьте в каждую лунку по два миллилитра маркированной среды. Накройте планшет для культивирования тканей, чтобы предотвратить воздействие прямого комнатного освещения, и быстро поместите клетки обратно в инкубатор.

Инкубируйте клетки в течение 45 минут при 37 °C. Подготовьте оптическую систему: сначала включите ртутную дуговую лампу. Затем включите компьютер, микроскоп, камеры и лазер; подключите устройство цифрового микрозеркала (DMD) в систему с вращающимся диффузором.

Затем посмотрите в окуляр микроскопа, чтобы проверить соосность оптического ввода. Поле зрения должно быть ярко освещено лазерным светом. Для установки образца нанесите одну или две маленькие капли иммерсионного масла на объектив с масляной иммерсией 63 x, когда он находится в крайнем нижнем положении.

Затем установите на предметный столик предметное стекло с сеткой линий с регулярным интервалом в 10 µm, называемое градиентом, и поднимите объектив так, чтобы иммерсионное масло обеспечило фокусировку. Далее сфокусируйтесь на шестигранном крае поля конденсора. Отрегулируйте положение так, чтобы было достигнуто центральное освещение по Кёлеру.

Шестигранная кромка должна быть центрирована в окуляре и четко сфокусирована. Затем с помощью ручек позиционирования диафрагмы конденсора центрируйте поле диафрагмы конденсора относительно поля зрения. Запустите программу IP lab и введите настройки для работы камеры.

Убедитесь, что камера переведена в режим передачи кадров. Выполните команду acquire focus для запуска предварительного просмотра в реальном времени. Затем задайте префикс индекса и путь к папке, в которой будут сохранены изображения.

Затем запустите получение RS-изображения. Установите параметры работы камеры CoolSnap. Режим синхронизации (clocking mode) должен быть установлен на «normal».

Запустите программное обеспечение DMD. Выберите «dark field iris» в меню скриптов. Затем нажмите «load» и «reset».

Для ручного запуска скрипта установите переключатель optiv микроскопа в окне просмотра в положение LSM. Это направит изображение через DMD в согласованной оптической системе, проецируя изображение в темном поле на ПЗС-матрицу камеры Cascade One.

Изображение в темном поле должно появиться в окне предварительного просмотра в IP lab. При необходимости настройте фокус изображения в окне предварительного просмотра. Установите время экспозиции на достаточном уровне, чтобы обеспечить сигнал не менее 10 000 отсчетов на изображении.

Затем сделайте снимок поля зрения, используя команду acquire single после завершения сбора данных. Используйте команду save as indexed, чтобы сохранить изображение на диск. Изображение GTI позволяет измерить размер поля зрения.

Теперь переместите образец GTI так, чтобы он находился за пределами поля зрения и была видна только фоновая область. Сделайте снимок фона с временем экспозиции, достаточным для получения не менее 5 000 отсчетов. Это изображение поможет при вычитании фона из неотфильтрованных снимков.

Теперь для получения изображений фона с габоровской фильтрацией загрузите скрипт банка фильтров Габора в программное обеспечение управления DMD. Запустите скрипт целиком, чтобы поместить фильтры в бортовую память DMD. После буферизации всего скрипта может потребоваться несколько минут.

Используйте маркеры начала и конца в программном обеспечении DMD, чтобы гарантировать, что в один момент времени загружен только один набор фильтров, соответствующий одному фильтру Габора. Запустите скрипт для получения отфильтрованных изображений фона. Предварительный просмотр изображения в реальном времени должен измениться с темного поля на отфильтрованное изображение.

Для этого фильтра откройте скрипт сбора данных в IP lab с диска. Отрегулируйте время экспозиции, чтобы обеспечить получение не менее 2000 отсчетов. Во время работы скрипта DMD отключите предварительный просмотр в IP lab и запустите скрипт сбора данных.

Это позволит автоматически получить индекс и сохранить отфильтрованное изображение на диск. После получения первого изображения остановите выполнение скрипта в DMD. Удалите использованные команды из скрипта.

Затем замените стартовые и стоповые маркеры в начале и конце следующего набора фильтров. Повторяйте процесс сбора данных в лаборатории IP до тех пор, пока не будет использован весь набор фильтров, а все отфильтрованные изображения не будут получены и сохранены. Подготовьтесь к посеву клеток, включив паяльник на лабораторном столе и нагрев среду L 15 до 37 °C.

Оборудуйте рабочее место, подготовив бумажные полотенца и салфетки Kimwipe для сбора пролитой среды и поддержания чистоты в рабочей зоне. Изготовьте несколько фитилей, разрывая и скручивая салфетки Kimwipe. Фитили будут использоваться для отвода жидкости через клеточную пластину.

Затем с помощью металлического держателя образцов соберите «сэндвич» ячейки. С помощью шприца нанесите тонкий слой вакуумной смазки по верхнему периметру отверстия в обработанной металлической пластине, продлевая ее примерно до середины пазов с каждой стороны. Осторожно поместите чистое покровное стекло номер один на смазку.

Переверните планшет и нанесите вазелин вокруг отверстия. Выключите свет в помещении, используя стерилизованные этанолом одноразовые смотровые перчатки. Извлеките клетки из инкубатора.

Извлеките из шестилуночного планшета покровное стекло, которое будет использоваться в эксперименте. Тщательно просушите покровное стекло. Затем прижмите покровное стекло стороной ячейки вниз к смазанной металлической пластине над смотровым отверстием.

Закрепите клетки внутри планшета. Убедитесь, что не осталось воздушных зазоров и что смазка создала водонепроницаемый затвор для последующего добавления среды. Теперь переверните планшет обратно, добавляя среду пипеткой по 200 µL за раз.

Добавьте предварительно подогретую среду L 15 в «сэндвич» через прорезь между верхним покровным стеклом и металлической пластиной, пока жидкость почти не достигнет прорези с противоположной стороны. Затем промойте клетки, приложив фильтровальную бумагу (фитилек) к противоположной прорези и внеся дополнительные 200 µL среды в «сэндвич». Среда будет перетекать с одной стороны на другую, в то время как фильтровальная бумага будет удалять старую среду.

На этом этапе следует соблюдать осторожность, чтобы в жидкости не образовывались пузырьки. Повторите эту процедуру два-три раза, используя новый фитиль для каждого промывания. Теперь снова переверните планшет, поддерживая его за края, чтобы жидкость осталась в резервуаре ячейки.

Окуните паяльник в стакан с вексом, чтобы быстро расплавить часть вещества, которое затем прилипнет к жалу паяльника. С помощью жала паяльника осторожно нанесите расплавленный векс по краям нижнего покровного стекла. Продолжайте окунать паяльник и наносить векс по всему периметру покровного стекла, припаивая его к металлической пластине.

Это создает надежный механический затвор, чтобы покровное стекло не отделилось от планшета во время наблюдения. Удалите любые остатки с нижней поверхности покровного стекла, свернув салфетку Kimwipe и протерев стекло.

Плавно введите покровное стекло одним скользящим движением, чтобы в центре, где будет проводиться наблюдение, оно оставалось максимально чистым. Верните планшет с шестью лунками в инкубатор. Перенесите планшет с клетками в лабораторию оптики и установите его под объектив.

Как и прежде, найдите область со здоровыми клетками и получите изображение этого поля зрения в темном поле. Затем настройте микроскоп в режиме дифференциального интерференционного контраста (DIC), убедившись, что время экспозиции подобрано правильно. Получите DIC-изображение с помощью каскадной камеры.

В данной установке флуоресцентные изображения регистрируются с помощью камеры cool SNAP, в то время как микроскоп остается настроенным на режим DIC. Установите VAR микроскопа на один x, а видоискатель — на 100% бинокуляра, и перенаправьте изображение из окуляра на камеру. Разместите синий светодиод над конденсатором для освещения поля зрения.

Затем предварительно просмотрите поле зрения на изображении RSS и настройте точную фокусировку. При необходимости получите изображение в режиме DIC и сохраните его на диск. Обратите внимание на то, чем поле зрения отличается от того, которое было получено с помощью каскадной камеры.

Эти изображения должны быть совмещены на этапе анализа эксперимента. Затем установите флуоресцентный фильтр в рабочее положение и получите изображение флуоресценции, кратковременно включив возбуждающий свет с помощью затвора микроскопа, и выключите его сразу после завершения получения снимка. Чтобы минимизировать фотовыгорание, сохраните изображение флуоресценции на диск.

Для получения отфильтрованных изображений настройте микроскоп по полю и направьте свет через порт LSM. Как и прежде, запустите весь скрипт банка фильтров Габора, чтобы завершить сбор данных для одной временной точки, пока клетки всё еще находятся на предметном столике и поле зрения не нарушено. Используйте метод капиллярного впитывания, чтобы заменить обычную среду L 15 на такую же среду, содержащую 1 µM раствор STS.

В ходе эксперимента добавляйте дополнительную среду, чтобы предотвратить высыхание, внося ее пипеткой в желобок планшета с клетками, не снимая его со столика и не смещая поле зрения. Затем повторите эти шаги для последующих временных точек до завершения эксперимента. Собранные данные будут включать большое количество отфильтрованных изображений, которые необходимо обработать для извлечения данных о субклеточных структурах.

Здесь представлены два примера экспериментов. На данном рисунке показана серия последовательных изображений образца морских диатомовых водорослей. Ориентированные структуры отчетливо видны.

При визуализации в темном поле оптически отфильтрованные изображения с обозначениями от пяти равно 0 градусов до пяти равно 160 градусов представлены рядом с неотфильтрованным изображением образца. Для сравнения представлен набор из девяти изображений диатомеи, отфильтрованных с помощью фильтров Габора, которые были обработаны попиксельно для определения ориентации объекта.

Для каждого пикселя максимальный сигнал делили на средний сигнал в зависимости от ориентации фильтра для получения значения соотношения сторон. В данном случае соотношение сторон, близкое к единице (отмечено синим цветом), указывает на области, в которых отсутствует предпочтительный угол отклика. Более высокие значения (отмечены красным цветом) указывают на области с более выраженным предпочтительным углом отклика.

Яркость и значимость кода общего отклика фильтра Габора, а также ориентация фильтра, дающая максимальный сигнал в каждом пикселе, соответствуют направлению, перпендикулярному ориентации лежащего в основе объекта. Ориентация частиц субструктуры закодирована на векторном графике (quiver plot), где каждая линия точно совпадает с локальной ориентацией объекта, видимой в нефильтрованном темном поле. Векторный график отображает ориентацию объектов с интенсивностью отклика более 10% от максимальной.

На этих изображениях в темном поле и с использованием оптических фильтров представлено поле с живыми эндотелиальными клетками быка; изображения с фильтрацией впоследствии получали каждые 20 минут в течение трех часов после обработки индуктором апоптоза стоauroспорином. Здесь карта соотношения сторон на верхней панели и флуоресцентные изображения митохондрий на нижней панели представлены в зависимости от времени. Цветовой тон отражает степень ориентации; как и ранее, эти временны́е графики позволяют сравнить снижение степени ориентации соотношения сторон частиц в эндотелиальных клетках, обработанных staurosporine; отдельные кривые представляют собой временны́е графики для каждой отдельной клетки.

Ориентация капли ограничена теми областями клеток, которые совпадают с флуоресцентными областями. Таким образом, проверка на соответствие флуоресценции завершена. Данный этап переходит в разряд архивных.

Таким образом, в последующих экспериментах измерения митохондрий можно проводить, пропуская этапы флуоресцентной визуализации и напрямую используя метод оптического рассеяния. Мы продемонстрировали, как контролировать фрагментацию митохондрий при апоптозе с помощью сигнатур рассеяния света на основе фильтров Габора. При выполнении данной процедуры важно обеспечить надлежащую подготовку образцов, а также правильную юстировку и калибровку оптической установки.

Итак, давайте перейдем к наблюдению и совместной работе с экспериментами в пользовательском интерфейсе.