MALDI пробоподготовки: ультра тонкий слой Метод
29 апреля 2007 г.
Это видео демонстрирует подготовку ультратонкие матрицы / анализируемого слоя для анализа пептидов и белков Matrix-активированная лазерная десорбция ионизации масс-спектрометрии (MALDI-MS).
Добро пожаловать в учебное пособие лаборатории CHI по методу ультратонкого слоя, который особенно полезен для точного определения массы белков. В связи с высокой чувствительностью масс-спектрометрии для очистки пластины мы используем только реагенты степени чистоты для ВЭЖХ, а также латексные или нитриловые перчатки без талька. Промывайте пластину попеременно метанолом и водой, и в завершение — снова метанолом.
После каждого промывания осторожно удаляйте излишки растворителя с помощью салфетки для линз. Эти этапы промывки можно повторять столько раз, сколько потребуется для достижения чистоты планшета. Очищенный и высушенный планшет следует использовать немедленно.
Нанесите и распределите от 20 до 30 µL раствора субстрата для тонкого слоя по чистой пластине MALDI. Для равномерного распределения раствора без повреждения поверхности пластины используйте наконечник дозатора P20 или P200. По мере высыхания тонкого слоя осторожно удалите оставшиеся капли воды, если они имеются, с помощью салфетки Kimwipe.
Затем аккуратно протрите пластину одним плавным движением с помощью салфетки Kimwipe, чтобы правильно сформировать тонкий слой. В завершение очистите края пластины, чтобы избежать загрязнения масс-спектрометра. Перед нанесением образца крайне важно протестировать тонкий слой.
Если тестовое пятно сохнет слишком долго и кристаллы оказываются неоднородными, проблема может заключаться в самом тонком слое или в растворе матрицы; в этом случае очистите пластину, заново нанесите тонкий слой и проведите повторный тест. При нанесении пробы на тонкий слой не допускайте полного испарения пятен досуха. Вместо этого, как только кристаллизация замедлится и прекратится, удалите излишки растворителя.
При использовании вакуумного аспиратора следует учитывать, что присутствие таких загрязнителей, как соли и детергенты, а также высокая концентрация аналита могут препятствовать кристаллизации. Дальнейшее разбавление образца может улучшить процесс кристаллизации. Разместите «муравьев» (Spots the Ants) в непосредственной близости от образца. Это позволит провести псевдовнутреннюю калибровку, при которой планшет перемещается из точки нанесения образца в точку калибровки.
При сборе образцов добавление нескольких лазерных импульсов CAS к спектру обеспечивает более высокую точность калибровки масс, чем использование только внешней калибровки. Очень важно удалить любые загрязнения, такие как соли или детергенты, которые могут помешать ионизации аналита. Для этого нанесите ледяную 0,1% раствор трифторуксусной кислоты в воде степени чистоты для ВЭЖХ непосредственно на пятна.
Удалите промывочный раствор с помощью вакуумного аспиратора, как показано здесь. Данный метод позволяет получить отличные спектры как для мембранных, так и для растворимых белков.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном видео демонстрируется процесс подготовки ультратонкого слоя матрицы/аналита для анализа пептидов и белков с помощью масс-спектрометрии с матрично-активированной лазерной десорбцией-ионизацией (MALDI-MS). Этот метод имеет решающее значение для точного определения массы белков.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Масс-спектрометрия
- Анализ белков
- Аналитическая химия
Теоретические основы
- Масс-спектрометрия представляет собой высокочувствительный метод анализа биомолекул.
- Подготовка планшета для образцов имеет решающее значение для получения точных результатов.
- Для очистки рекомендуется использовать реагенты степени чистоты для ВЭЖХ.
- Надлежащие методы обращения и очистки повышают качество анализа.
Цель исследования
- Продемонстрировать метод нанесения ультратонкого слоя для MALDI-MS.
- Обеспечить точное определение массы белков.
- Предоставить руководство по оптимальным методам подготовки образцов.
Используемые методы
- Использование реагентов степени чистоты HPLC.
- Очистка пластины метанолом и водой.
- Удаление излишков растворителя салфеткой для оптики.
- Немедленное использование очищенной пластины для анализа.
Основные результаты
- Продемонстрированы эффективные методы очистки предметного стекла.
- Подчеркнута важность использования подходящих материалов.
- Показаны этапы подготовки ультратонкого слоя.
- Представлены рекомендации по сохранению целостности образца.
Выводы
- Метод ультратонкого слоя имеет решающее значение для точной масс-спектрометрии.
- Правильные методы очистки и подготовки являются обязательными.
- Следование общепринятым рекомендациям может значительно улучшить результаты анализа.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Точное определение массы белков имеет решающее значение для валидации мишеней и идентификации ведущих соединений на ранних этапах поиска. Метод подготовки проб для MALDI с использованием ультратонкого слоя повышает качество данных за счет увеличения устойчивости к примесям и улучшения пространственной однородности, что обеспечивает надежную оценку соединений. Данный метод позволяет с высокой степенью уверенности характеризовать белки, снижая неопределенность механизмов при выборе доклинических моделей.
Стратегическое применение в исследованиях и разработках биофармацевтики
Первичное обнаружение и валидация мишени
- Научная ценность: Обеспечивает точное определение массы белков, что способствует проверке терапевтических гипотез и функциональной валидации мишеней.
- Практическая ценность: Обладает повышенной устойчивостью к солям и детергентам, что снижает количество ложноотрицательных результатов в образцах, склонных к загрязнению примесями.
- Прогностическая ценность: Улучшает разрешение и пространственную однородность, повышая достоверность идентификации белков и определения статуса их модификаций.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: позволяет получать высококачественные, воспроизводимые спектры, необходимые для стандартизации анализа и обеспечения согласованности количественных показателей.
- Практическая ценность: включает простые и надежные этапы, совместимые с условиями высокопроизводительного скрининга.
- Масштабируемость: обеспечивает подготовку валидированных планшетов с образцами для последующих этапов работы, что позволяет использовать платформу в различных проектах.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная преемственность: обеспечивает анализ как мембранных, так и растворимых белков, что позволяет проводить характеристику систем, имеющих значение для изучения заболеваний.
- Механистическое снижение рисков: способствует точному определению массы белков в широком диапазоне (до 380 kDa), что помогает в оптимизации ведущих соединений.
- Соответствие доклиническим моделям: применимо к ионным каналам, транспортерам и рецепторам, что поддерживает валидацию мишеней в физиологически релевантных моделях.
Интеграция в конвейер и рабочий процесс
Метод ультратонкого слоя вписывается в континуум открытий — от ранней валидации мишеней и идентификации ведущих соединений до доклинического профилирования, обеспечивая надежный анализ белков на каждом этапе.
- Биология открытий: Обеспечивает проверку гипотез путем предоставления точных данных о массе для идентификации и характеристики белков.
- Скрининг: Обеспечивает воспроизводимые количественные результаты, что позволяет проводить надежную оценку соединений при разработке анализа.
- Аналитика: Позволяет получать масс-спектры высокого разрешения с пространственной однородностью, что улучшает сопоставимость данных при различных условиях.
- Трансляционные исследования: Обеспечивает преемственность между этапом открытий и доклиническими исследованиями за счет согласованного анализа массы белков в образцах различных типов.
- Корпоративное использование: Представляет собой стандартизированный, надежный метод подготовки проб, применимый к различным классам белков и проектам.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: Повышение достоверности прогнозирования при определении массы белка, снижение механистической неопределенности при валидации мишеней.
- Операционная ценность: Стандартизация, воспроизводимость и устойчивость к распространенным загрязнителям, таким как соли и детергенты.
- Стратегическая ценность: Принятие более обоснованных решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) за счет повышения качества данных, что снижает биологические риски на поздних этапах.
- Влияние на портфель: Приоритизация с учетом рисков на основе надежных данных о характеристиках белков.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с образцами для масс-спектрометрии и знание принципов MALDI-MS.
- Необходим доступ к реагентам степени чистоты для ВЭЖХ, вакуумному аспиратору и пластинам, совместимым с MALDI.
- Требуются стандартизированные процедуры очистки и сушки для обеспечения однородности слоя.
- Необходима адаптация под различные концентрации аналитов и матрицы образцов.
- Ограничение: необходимость использования пластин сразу после очистки для предотвращения повторного загрязнения.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
2:05
Step 5: test of the thin layer
2:50
Step 6: sample application
3:47
Step 7: calibrant application
1:52
Step 4: preparation of the matrix solution
0:58
Step 3: making the thin layer substrate
0:20
Step 1: cleaning of the sample plate
4:20
Step 8: washing step
0:46
Step 2: preparation of the thin layer substrate solution
5:05
Step 9: acquisition of mass spectra
