Видео биоинформатики Анализ человеческих эмбриональных роста клеток колонии стволовых
20 мая 2010 г.
Видео биоинформатики является автоматизированной обработки, анализа, понимания и анализа данных биологических пространственно-временных данных, извлеченных из микроскопических видео. Целью данной статьи является демонстрация метода измерения человеческих эмбриональных стволовых клеток, роста колоний методом видео биоинформатики.
В данном протоколе демонстрируется метод видеобиоинформатики для измерения роста колоний эмбриональных стволовых клеток человека путем анализа видеозаписей с функцией таймлапса, полученных в инкубаторе icon bio station CT, оснащенном камерой для видеосъемки. Колонии эмбриональных стволовых клеток человека (HESC) культивируют до 70% конфлюэнтности, пересевают и инкубируют в течение 48 часов, после чего проводят видеосъемку колоний HESC в течение еще 48 часов в Biot ct. Скорость роста определяется с использованием алгоритмов сегментации, улучшения изображения и измерения, разработанных в программном обеспечении CL quant.
Рецепты валидируются путем сравнения с Adobe Photoshop — инструментом анализа изображений, позволяющим точно вручную подогнать маску к каждой колонии. Развивающаяся область видеобиоинформатики может быть использована для автоматизации обработки, анализа и извлечения биологических данных из микроскопических видео. Здравствуйте, я Серена Лин из лаборатории доктора Пру Талбота на кафедре клеточной биологии и нейробиологии Калифорнийского университета в Риверсайде.
Здравствуйте, я Шон Фино из лаборатории Талбота. Здравствуйте, я Ти Сатиш из программы аспирантуры по клеточной, молекулярной и developmental биологии. Сегодня мы продемонстрируем вам, как измерять рост колоний эмбриональных стволовых клеток человека с помощью инструментов видеобиоинформатики.
Мы используем эту процедуру в нашей лаборатории для измерения влияния токсикантов окружающей среды на поведение эмбриональных стволовых клеток человека. Мы продемонстрируем эту процедуру в нашем новом центре по работе со стволовыми клетками. Итак, приступим.
Для подготовки HESC к видеоанализу выращивайте HESC на шестилуночных планшетах, покрытых Matrigel, до достижения 70% конфлюэнтности; аспирируйте среду из одной лунки с HESC и дважды промойте ее одним миллилитром PBS. Добавьте один миллилитр Accutase и инкубируйте в течение одной минуты при 37 °C в среде с 5% CO2. Затем добавьте в лунку от 10 до 12 стеклянных шариков и осторожно встряхивайте планшет до полного открепления колоний.
Нейтрализуйте Accutane, используя 1 mL поддерживающей среды для человеческих эмбриональных стволовых клеток или кондиционированной среды мышиных эмбриональных фибробластов. Соберите отделившиеся клетки без бусин в коническую пробирку объемом 15 mL и центрифугируйте при 200 G в течение трех минут. Слейте супернатант и ресуспендируйте осадок в 500 µL свежей поддерживающей среды для человеческих эмбриональных стволовых клеток или M-T-E-S-R. Покапельно внесите по 100 µL суспензии HESC в несколько лунок 12-луночного планшета, покрытого Matrigel.
Осторожно покачайте планшет вперед-назад и осмотрите культуры под световым микроскопом, чтобы убедиться, что клеточные кластеры равномерно распределены по лункам. Поместите планшет в инкубатор при 37 °C и 5% carbon dioxide на 48 часов, чтобы клетки успели распластаться и вырасти до размеров, позволяющих легко их визуализировать. Через 48 часов аспирируйте среду и промойте лунки 500 µL PBS для удаления неприкрепившихся клеток, затем добавьте в каждую лунку 500 µL среды M-T-E-S-R.
Сразу поместите планшет в систему Biot CT и начните сбор изображений в режиме таймлапс. Старайтесь выбирать поля с отдельными единичными колониями, которые вряд ли срастутся с соседними колониями. В данном протоколе видеозапись клеток ведется в течение дополнительных 48 часов с интервалом между кадрами семь минут.
Для начала создания рецепта сегментации вручную просмотрите все видео, чтобы убедиться, что в нем присутствует одна колония, которая остается в фокусе на протяжении всего периода записи. После этого откройте мастер сегментации в программном обеспечении CL quants и нажмите кнопку «Далее». Выберите нужный канал изображения и нажмите кнопку «Далее».
Выберите «soft matching» и нажмите «Next». Выделите одну или две интересующие области, обведя внешний край до центральной части колонии. Эта область должна быть как можно меньше, но при этом быть репрезентативной для всей колонии.
Не выбирайте слишком много областей, так как это может привести к неточному применению маски. Нажмите кнопку «Далее». Выберите «Не нужны области» (Don't want regions), обводя области, которые не являются частью колонии и не являются частью фона.
В этих областях присутствуют паттерны, которые необходимо подавить, например, частицы мусора и погибшие клетки. Нажмите «Далее». Выберите фон, обведя области, которые не являются колониями, мусором или погибшими клетками.
Фон должен быть однородным и присутствовать в каждом кадре. Обычно в качестве фона выбирают серую область вокруг колонии. Нажмите кнопку «Далее».
Если маска неточно охватывает интересующую область, над этой областью должна отображаться цветная маска. Если требуется изменить маску, можно увеличить или уменьшить диапазон порога сегментации в правом нижнем углу экрана. Выберите обновление областей мягкого сопоставления.
Это позволяет изменять области «желаемого» (want), «нежелательного» (don't want) или фоновые области. Если маска удовлетворительна, выберите «apply threshold» (применить порог) и «save my mask» (сохранить мою маску). Затем нажмите кнопку «next» (далее).
После этого маска отобразится другим цветом. Выберите «finish» (завершить). В правом верхнем углу программного обеспечения должен появиться рецепт сегментации (segmentation recipe).
При желании переименуйте рецепт, щелкнув по нему правой кнопкой мыши и введя новое имя. Чтобы применить рецепт, щелкните правой кнопкой мыши и наведите курсор.
Примените рецепт. Появится меню, позволяющее выбрать количество используемых кадров. Установите интервал между кадрами равным 20 кадрам для обеспечения точности маски.
Случайным образом вручную проверьте 10% кадров, к которым была применена маска, чтобы создать рецепт улучшения, который удаляет нежелательные области в мусоре. Щелкните правой кнопкой мыши по папке с рецептами улучшения, а затем выберите «Новый». Должен отобразиться новый рецепт улучшения на основе исходного поля зрения.
Наведите курсор мыши на значки на панели инструментов, чтобы найти кнопку переключения модуля улучшения, расположенную справа от изображения, и нажмите на неё. Выберите выпадающее меню маркировки. Выберите «marking for connected» (маркировка для связанных), затем выберите «marking for connected two» (маркировка для связанных два).
Должна появиться новая панель задач. Возьмите исходную маску из рецепта сегментации и перетащите её в поле ввода. Теперь на панели должен отобразиться номер входной маски.
Перетащите значок с номером маски ввода на значок нулевой маски. Найдите параметр «min size» на панели задач и настраивайте число до тех пор, пока не будет отображаться только интересующая область. Обязательно нажимайте «execute» при каждой попытке подгонки.
Когда настройка минимального размера станет удовлетворительной, нажмите на предыдущий рецепт усиления в нижней части экрана и выберите «сохранить в рецепт» (save to recipe). Программное обеспечение предложит перезаписать выбранный рецепт; выберите «да» (yes). Проверьте рецепт усиления, используя ту же процедуру, что и при проверке сегментации пятен.
Если результаты сегментации и улучшения изображения вас устраивают, приступайте к созданию шаблона измерений. Для этого выберите «create measurement template» на панели инструментов справа. В окне измерений выберите «move cursor over clip art cell figure».
Удерживая клавишу Ctrl, выберите ячейку в разделе morphology, снимите флажок с параметра default и установите флажок с параметром area. Затем закройте окно шаблона. Выберите значок.
Создайте рецепт измерения. Переименуйте рецепт. Перейдите на вкладку шаблонов и выберите ее. В правом верхнем углу перетащите ранее созданный шаблон измерения в окно измерения.
Нажмите «Да», чтобы продолжить в окне рецепта измерений, и выберите сопоставление каналов. Затем выберите сопоставление масок для выделения всей клетки. После этого выберите опцию «Whole cell» (Вся клетка). Для использования улучшенной маски выберите рецепт измерений на вкладке «Recipe».
В главном окне выберите значок сохранения в окне рецепта измерений. Затем закройте окно. Далее закройте и снова откройте поле зрения. Щелкните правой кнопкой мыши по папке со списком рецептов, выберите «создать», перетащите рецепты в список в порядке их применения, выберите «заблокировать список рецептов» и последовательно примените рецепты к видеоданным с помощью Adobe Photoshop.
Анализировали каждый 20-й кадр одних и тех же колоний. Вручную откройте кадр с изображением колонии в Adobe Photoshop. Выберите инструмент «Волшебный жезл» (Magic Wand tool) на панели инструментов.
Щелкните по области вокруг колонии так, чтобы было охвачено все поле, за исключением области самой колонии. Убедитесь, что пунктирная линия проходит точно по периферии колонии, а не внутри нее. Если пунктирная линия не охватывает периферию, соответствующим образом измените значение допуска (tolerance) на верхней панели инструментов.
Выберите функцию «редактировать» в режиме быстрой маски на панели инструментов и нажмите на колонию, чтобы выделить её. В окне выберите в выпадающем меню пункт «гистограмма». Значение кэша должно быть установлено на один.
Если значение кэша равно двум, нажмите знак восклицания в выражении, чтобы изменить кэш на один. Запишите значение пикселя в таблицу. Повторите вышеописанный процесс для каждого 20-го кадра.
Данные, собранные с помощью Photoshop и программного обеспечения CL quant, затем можно построить на одном графике. Наш протокол количественной оценки роста колоний HESC демонстрирует одно из применений видеобиоинформатики для решения биологической задачи. Здесь мы приводим график, сравнивающий увеличение размера колоний за 48 часов, определенное с помощью ПО CL quant и Adobe Photoshop.
На графике представлены пять различных колоний, каждая из которых была проанализирована с помощью двух программных пакетов. Каждая колония обозначена отдельным цветом. Сплошные линии получены с использованием программного обеспечения sail quant, а пунктирные линии — с помощью Photoshop.
График необработанных данных показывает, что оба метода измерения хорошо согласуются с учетом того, что колонии имеют разный начальный размер. На данном рисунке данные перестроены в виде процента увеличения размера колонии. Скорость роста схожа независимо от начального размера колонии, и оба метода анализа дают аналогичные результаты.
На следующем графике представлены средние значения данных о процентном изменении роста колоний HESC. Этот график наглядно демонстрирует хорошее соответствие между анализом, проведенным с помощью видеобиоинформатики и Adobe Photoshop. Мы только что показали вам, как измерять рост колоний эмбриональных стволовых клеток человека с использованием инструментов видеобиоинформатики.
При выполнении данной процедуры с помощью фазово-контрастной микроскопии обязательно захватывайте гало вокруг колонии для точного ее выбора программным обеспечением. Также важно помнить, что вместо продемонстрированного нами протокола можно использовать другие методы культивирования, инкубации и записи видео. После разработки и валидации алгоритмов анализ будет проводиться значительно быстрее и с меньшей экспериментальной вариабельностью, чем при ручном анализе.
На этом всё. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлен биоинформатический видеометод измерения роста колоний эмбриональных стволовых клеток человека с использованием анализа видео в режиме таймлапс. Этот метод автоматизирует обработку и анализ биологических данных, извлеченных из микроскопических видеозаписей.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Видеобиоинформатика
- Биология стволовых клеток
- Микроскопическая визуализация
Теоретические основы
- Эмбриональные стволовые клетки человека (HESC) имеют решающее значение для исследований в области биологии развития.
- Анализ видеозаписей с функцией таймлапса позволяет получить представление о динамике роста клеток.
- Автоматизированные методы могут повысить эффективность обработки данных.
- Методы сегментации и измерения необходимы для точного анализа.
Цель исследования
- Продемонстрировать метод измерения роста колоний HESC.
- Провести валидацию методов видеобиоинформатики в сравнении с традиционными инструментами анализа изображений.
- Внести вклад в область автоматизированного анализа биологических данных.
Используемые методы
- Видео с таймлапсом, полученные из инкубатора, оснащенного камерой.
- Рецепты улучшения сегментации и измерения, разработанные с помощью программного обеспечения CL quant.
- Сравнение автоматизированных измерений с ручным анализом с использованием Adobe Photoshop.
- Съемка колоний HESC в течение 48 часов после инкубации.
Основные результаты
- Метод видеобиоинформатики позволил успешно измерить скорость роста колоний.
- Автоматизированный анализ продемонстрировал согласованность с результатами ручных измерений.
- Методы сегментации повысили точность оценки роста.
- Данное исследование подчеркивает потенциал видеобиоинформатики в биологических исследованиях.
Выводы
- Видеобиоинформатика является ценным инструментом для анализа роста стволовых клеток.
- Данный метод позволяет оптимизировать сбор и анализ данных в биологических исследованиях.
- Дальнейшая разработка автоматизированных методов может повысить эффективность исследований.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Количественная оценка динамики роста колоний стволовых клеток имеет решающее значение для анализа клеточных реакций на факторы окружающей среды и терапевтические препараты-кандидаты на ранних этапах поиска. Автоматизированная биоинформатика видеоданных снижает вариативность и увеличивает пропускную способность по сравнению с ручным анализом изображений, что обеспечивает надежный фенотипический скрининг. Этот подход позволяет принимать обоснованные решения о продолжении или прекращении исследований (go/no-go) за счет получения количественных и воспроизводимых данных о кинетике расширения колоний.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы, используя рост колоний в качестве функционального показателя поведения стволовых клеток в экспериментальных условиях.
- Практическая ценность: способствует снижению биологических рисков за счет объективной количественной оценки скорости экспансии колоний в различных группах терапии.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Подготовка валидированных биологических систем для последующих этапов анализа путем внедрения стандартизированного автоматизированного измерения кинетики роста колоний.
- Практическая ценность: Повышение стандартизации и воспроизводимости анализа за счет использования программного обеспечения для сегментации и протоколов измерения, которые сводят к минимуму влияние человеческого фактора.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: обеспечивает непрерывность исследования систем в контексте заболеваний, позволяя осуществлять лонгитюдный мониторинг роста колоний стволовых клеток в качестве биомаркера жизнеспособности и отклика клеток.
- Практическая ценность: облегчает принятие решений о дальнейшем продвижении проекта с учетом рисков за счет получения согласованных, количественно измеримых данных о росте, которые коррелируют со здоровьем и стабильностью клеток.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод интегрируется в цикл научных исследований — от проверки гипотез до идентификации перспективных соединений-лидеров — за счет получения количественных фенотипических данных о динамике колоний стволовых клеток.
- Открытия в биологии: способствует проверке гипотез и уточнению сигнальных путей путем установления связи между измерениями роста колоний и конкретными генетическими или средовыми воздействиями.
- Скрининг: обеспечивает готовность и воспроизводимость анализа благодаря автоматизированному программному анализу, который стандартизирует количественную оценку скорости роста в различных экспериментах.
- Аналитика: предоставляет количественные измерения зависимых переменных (площадь колонии в пикселях с течением времени), что позволяет объективно сравнивать скорость роста при различных условиях.
- Трансляционные исследования: связывает фундаментальные открытия с доклиническими исследованиями, предлагая интерпретируемый показатель поведения стволовых клеток, применимый для моделирования заболеваний.
- Корпоративное повторное использование: функционирует как универсальный инструмент для различных проектов, так как валидированные протоколы могут быть применены к любым данным видеосъемки с таймлапсом для последовательного анализа роста.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает прогностическую достоверность за счет снижения механистической неопределенности при оценке поведения стволовых клеток посредством объективного автоматизированного количественного анализа.
- Операционная ценность: Улучшает стандартизацию и масштабируемость за счет замены ручного покадрового анализа биоинформационными рабочими процессами пакетной обработки видео.
- Стратегическая ценность: Повышает эффективность использования капитала и снижает биологические риски на поздних этапах, обеспечивая раннюю приоритизацию линий стволовых клеток или условий на основе данных о показателях роста.
- Влияние на портфель: Обосновывает решения о продвижении с учетом рисков, предоставляя воспроизводимые количественные показатели роста, которые служат основой для выбора линий и оптимизации условий.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с программным обеспечением для анализа изображений и обработки видеоданных для разработки и валидации алгоритмов сегментации, улучшения качества и измерения.
- Зависит от стабильной инфраструктуры для таймлапс-визуализации, такой как интегрированная в инкубатор система камер, способная обеспечить согласованный захват кадров в течение длительного периода времени.
- Необходима межкомандная стандартизация параметров алгоритмов (например, интервал между кадрами, пороги маскирования) для обеспечения воспроизводимости результатов разными пользователями и в разных лабораториях.
- При применении алгоритмов к различным типам клеток, морфологиям колоний или форматам видео могут потребоваться корректировки и повторная оптимизация параметров.
- Практические ограничения включают зависимость от качества видео и стабильности фокусировки; заслоненные или смещающиеся колонии могут потребовать ручного вмешательства или корректировки алгоритма.
Часто задаваемые вопросы о биофармацевтике
Chapters in this video
0:00
Title
1:02
Introduction
1:40
Plating and Colony Formation of hESC for Video Data
6:40
Video Bioinformatics with CL-Quant Software -- Enhancement Recipe
3:48
Video Bioinformatics with CL -Quant Software -- Segmentation Recipe
8:19
Video Bioinformatics with CL -Quant Software -- Measurement Template
11:22
Comparison of CL-Quant and Adobe® Photoshop® for Video Analysis of hESC Colony Growth
10:08
Adobe® Photoshop® Measurement of hESC Video Data
12:27
Conclusion
