Эукариотические Polyribosome Анализ профиля
15 июня 2010 г.
В этой статье описывается протокол для извлечения переводе рибосом из эукариотических клеток. После извлечения, рибосомы разделены на monosomes и полирибосом сахарозы фракционирования градиент чтобы позволить различным рибосомных популяций для анализа. Таким образом, этот метод является золотым стандартом для изучения регуляции трансляции.
Общая цель данной процедуры заключается в разделении и сравнении фракций моносом и полисом из клеточных лизатов. Это достигается путем предварительного культивирования интересующих клеток. Вторым этапом процедуры является подготовка клеточного лизата.
Третьим этапом процедуры является центрифугирование лизата в градиенте сахарозы. Заключительным этапом является фракционирование градиента и визуализация различных популяций рибосом с помощью УФ-сканирования. В конечном итоге анализ профиля полисом позволяет получить результаты, демонстрирующие изменения в трансляции при различных экспериментальных условиях.
Здравствуйте, я Энтони Эспозито из лаборатории доктора Терри Госс Кинзи на кафедре молекулярной генетики, микробиологии и иммунологии Университета Мэриленда (UMD) и медицинской школы имени Дж. Роберта Вуда Джонсона. А я Маркус Льюис, также из лаборатории Кинси здесь, в RWJMS.
Сегодня мы продемонстрируем процедуру анализа полирибосом. Мы используем этот метод в нашей лаборатории для изучения изменений в синтезе белка, возникающих вследствие мутаций или воздействия факторов окружающей среды. Итак, приступим. Сахароза.
Градиенты следует готовить за один день до использования, чтобы они стали непрерывными. Смешайте соответствующие объемы стоковых растворов сахарозы с концентрацией 7% и 47%, чтобы получить по 48 миллилитров растворов сахарозы следующих концентраций: 7%, 17%, 27%, 37% и 47%. Добавьте в каждый раствор сахарозы одномнолярный DTT до конечной концентрации один миллимоляр. Для разлива градиентов прикрепите пастельную пипетку к шприцу объемом 20 миллилитров, зафиксировав и герметизировав соединение парафильмом.
Добавьте семь миллилитров 7% sucrose на дно центрифужной пробирки PolyAmer Ultra размером 1 x 3,5 дюйма. Затем, аккуратно поместив кончик пастернажской пипетки почти к самому дну пробирки, медленно добавьте семь миллилитров 17% sucrose под слой 7% раствора. Наливание каждого слоя должно занимать не менее 20 секунд.
Повторите процедуру, используя по семь миллилитров растворов сахарозы с концентрацией 27%, 37% и 47%, когда градиент будет сформирован. Вы должны увидеть четкие линии между слоями, что указывает на минимальное перемешивание. Храните все градиенты при температуре четырех °C в течение ночи вместе с роторами, флаконами и пробирками, которые будут использоваться для сбора образцов.
Для приготовления экстрактов из дрожжевых клеток сначала вырастите 100 мл культуры дрожжей до OD 600 от 0,8 до 1. Добавьте в культуру циклогексимид до конечной концентрации 100 µg/mL и продолжайте перемешивание при 30 °C в течение 15 минут. Через 15 минут перелейте культуру в центрифужную бутыль объемом 250 мл и поместите ее в лед.
С этого момента держите все образцы на льду. Центрифугируйте при 8,000 ×g в течение пяти минут при температуре 4 °C. Ресуспендируйте осадок в 10 мл ледяного лизирующего буфера и перенесите в полипропиленовые пробирки объемом 15 мл. Центрифугируйте при 5,900 ×g в течение трех минут при температуре 4 °C. Ресуспендируйте.
Ресуспендируйте осадок в 0,5 мл лизирующего буфера. Перенесите суспензию в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл, затем добавьте 0,5 мл охлажденных стеклянных шариков, промытых щелочью и кислотой. Перемешивайте клетки на вортексе четыре раза по 32 секунды, помещая пробирку на лед на 30 секунд между каждым интервалом.
Затем добавьте еще 0,5 миллилитра лизирующего буфера в центрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра и центрифугируйте при 5 000 ×g в течение пяти минут при температуре четырех градусов Цельсия. Перенесите супернатант в новую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра и центрифугируйте на максимальной скорости в течение 10 минут при температуре четырех градусов Цельсия.
Наконец, перенесите супернатант в новую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл. Экстракт можно хранить при температуре -80 °C до момента переноса лизата в сахарозный градиент. Приставьте кончик пипетки к стенке пробирки рядом с поверхностью градиента и аккуратно нанесите лизат поверх градиента.
Для градиента объемом 35 миллилитров обычно наносят 500 микroliters лизата. С помощью пинцета осторожно поместите пробирку с градиентом в кассету ротора с поворотными adapting- holders. Центрифугируйте градиенты при 100 000 ×g в течение четырех часов при температуре четыре градуса Celsius.
Примерно за 30 минут до завершения четырехчасового центрифугирования установите иглу в прокалыватель пробирок, а ручку — в онлайн-монитор абсорбции и флуоресценции. Включите питание монитора абсорбции, чтобы до начала анализа образцов была достигнута стабильная базовая линия.
Электронная регистрация профиля PolyZone может быть легко осуществлена в режиме реального времени путем подключения блока сбора данных DI 1 48 U. Для записи данных заполните шприцевой насос 50 миллилитрами florin nuts, используя настройку быстрого обратного потока. Убедитесь в отсутствии пузырьков воздуха.
Подсоедините шланг от шприца к проколки трубок. Кратковременно включите поток Flo inert со скоростью 6 мл/мин в прямом направлении. Чтобы удалить из шланга пузырьки воздуха, поместите под шланг в конце проточной кюветы серию пробирок для сбора стекающего образца.
Подготовьте ведерко со льдом с заранее сформированным углублением для размещения центрифужной пробирки с градиентом сахарозы. По завершении четырехчасового центрифугирования осторожно извлеките пробирки из ротора центрифуги и поместите их на лед, стараясь не нарушить градиенты.
Для анализа клеточных экстрактов установите градиентную пробирку на прокалыватель пробирок, подсоедините верхнюю часть пробирки к выходу и зафиксируйте ее. Поднимите нижнюю платформу к центрифужной пробирке так, чтобы игла проколола дно пробирки. Запустите поток Florin alert в прямом направлении со скоростью 6 мл/мин.
Как только жидкость начнет поступать в пробирку, следите за движением стрелки на онлайн-мониторе УФ-поглощения. Когда стрелка начнет двигаться, включите движение диаграммы, установив скорость на 60. По достижении конца профиля полирибосом прекратите подачу Flo inert в центрифужную пробирку и остановите движение диаграммы на мониторе абсорбции и флуоресценции.
Отодвиньте Flo inert из центрифужной пробирки обратно в шприц, запустив поток в обратном направлении на высокой скорости, следя за тем, чтобы сахароза из пробирки не попала в шприц. Открутите центрифужную пробирку от проколки, опустите иглу и извлеките пробирку. Здесь представлен типичный график экстракта рибосом, приготовленного из дрожжей в присутствии cyclo heximide.
Указаны пики УФ-поглощения, соответствующие полирибосомам, а также 60 s и 40 s рибосомам. Мы только что продемонстрировали вам, как проводить анализ полирибосом. При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости работать быстро, поддерживая образцы в охлажденном состоянии и обеспечивая защиту РНК от деградации.
На этом всё. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.
Обзор
В данной статье описывается протокол экстракции транслирующих рибосом из эукариотических клеток, позволяющий проводить анализ различных популяций рибосом. Метод основан на разделении рибосом на моносомы и полирибосомы с помощью фракционирования в сахарозном градиенте, что имеет решающее значение для изучения регуляции трансляции.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Клеточная биология
- Генетика
Теоретические основы
- Понимание функций рибосом имеет решающее значение для изучения синтеза белков.
- Полисомный профиль позволяет получить представление о регуляции трансляции.
- Методы экстракции рибосом являются основополагающими в исследованиях по молекулярной биологии.
- Факторы окружающей среды и мутации могут изменять синтез белков.
Цель исследования
- Разделение и сравнение фракций моно- и полирибосом из клеточных лизатов.
- Визуализация различных популяций рибосом с помощью УФ-детектирования.
- Анализ изменений трансляции при различных экспериментальных условиях.
Используемые методы
- Культивирование эукариотических клеток и подготовка клеточных лизатов.
- Центрифугирование в градиенте сахарозы.
- Фракционирование градиента для выделения популяций рибосом.
- Визуализация рибосомальных профилей с помощью мониторинга УФ-поглощения.
Основные результаты
- Успешное разделение моносом и полирибосом.
- Четкая визуализация популяций рибосом с помощью УФ-детектирования.
- Анализ регуляции трансляции при различных условиях.
- Изучение влияния мутаций на синтез белков.
Выводы
- Данный протокол является «золотым стандартом» для изучения регуляции трансляции.
- Он позволяет исследователям эффективно анализировать рибосомальную динамику.
- Полученные результаты способствуют пониманию молекулярных механизмов трансляции.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Анализ профилей полирибосом позволяет биофармацевтическим группам исследовать механизмы трансляционного контроля и выявлять дефекты синтеза белков на критических этапах поиска новых лекарственных средств. Этот метод дает количественное представление о глобальной и транскрипт-специфичной трансляции, что повышает прогностическую уверенность при валидации мишеней и снижении механистических рисков. Его адаптивность к различным эукариотическим системам обеспечивает широкую применимость для портфеля ранних этапов НИОКР и трансляционных исследований.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Позволяет проводить прямую оценку трансляционной регуляции при генетических или средовых воздействиях.
- Обеспечивает механистическую проверку гипотез путем разграничения дефектов инициации и элонгации/терминации.
- Способствует функциональной валидации мишеней за счет количественного определения изменений соотношения полирибосом и моносом.
- Предоставляет платформу для оценки влияния потенциальных терапевтических воздействий на синтез белка.
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает валидированные количественные показатели связывания рибосом для стандартизации анализа.
- Позволяет осуществлять воспроизводимое фракционирование и УФ-детектирование популяций рибосом.
- Обеспечивает подготовку биологических экстрактов, подходящих для последующего анализа мРНК или белков.
- Поддерживает скрининг соединений, модулирующих аппарат трансляции или регуляторные пути.
Трансляционные и доклинические исследования
- Связывает поиск трансляционных биомаркеров с пониманием механизмов регуляции синтеза белка.
- Обеспечивает преемственность от клеточных моделей к доклиническим системам путем адаптации протоколов для различных видов эукариот.
- Позволяет принимать обоснованные решения о дальнейшем продвижении с учетом рисков, выявляя трансляционные дефекты, связанные с моделями заболеваний.
- Обеспечивает понимание механизмов, лежащих в основе фенотипов, наблюдаемых в ходе доклинических исследований.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Полирибосомное профилирование интегрируется в континуум от этапа поиска до доклинических исследований, позволяя проводить проверку гипотез в отношении трансляции, что способствует как валидации мишеней, так и поиску перспективных соединений.
- Биология открытий: позволяет количественно оценить выход трансляции и выяснить специфические для конкретного пути регуляторные механизмы.
- Скрининг: обеспечивает надежное количественное фракционирование и данные УФ-абсорбции для подготовки анализа.
- Аналитика: обеспечивает количественное измерение популяций рибосом в режиме реального времени для сравнительного анализа.
- Трансляционные исследования: связывает клеточные и доклинические модели, позволяя адаптировать протоколы и согласовывать биомаркеры.
- Корпоративное повторное использование: функционирует как многократная платформа для различных трансляционных и механистических исследований в рамках программ НИОКР.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает прогностическую достоверность и снижает механистическую неопределенность в исследованиях трансляционного контроля.
- Операционная ценность: стандартизирует рабочие процессы экстракции, фракционирования и детекции для обеспечения воспроизводимости и масштабируемости.
- Стратегическая ценность: позволяет принимать решения о целесообразности дальнейшего продолжения разработки (go/no-go), выявляя «узкие места» трансляции и поддерживая экономически эффективную сортировку портфеля проектов.
- Влияние на портфель: обеспечивает приоритизацию мишеней и моделей с учетом рисков на основе точности трансляции.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы в области биологии рибосом и методов фракционирования в градиенте.
- Необходим доступ к оборудованию для ультрацентрифугирования и измерению УФ-поглощения.
- Требуется строгая стандартизация между исследовательскими группами для получения воспроизводимых результатов.
- Метод может быть адаптирован для систем дрожжей и млекопитающих с внесением необходимых модификаций в протокол.
- Целостность образцов и условия отсутствия РНаз имеют решающее значение для получения достоверных результатов.
