Дифференциация эмбриональных стволовых клеток в олигодендроцитов прекурсоров

Общая цель следующего эксперимента — получение предшественников олигодендроцитов из эмбриональных стволовых клеток посредством серии этапов культивирования в течение 30 дней. Это достигается путем первоначального формирования эмбриоидных телец из ЭС-клеток мыши для запуска дифференцировки клеток. На втором этапе эмбриоидные тельца обрабатывают малыми молекулами — ретиноевой кислотой и чистым морфином, которые индуцируют направленную дифференцировку клеток в линию олигодендроцитов.

Предшественники цитов. На третьем этапе, спустя еще 22 дня, тела эмбрионов подвергаются дезагрегации до состояния одиночных клеток. В культуре примерно 80% клеток представляют собой OPC.

Затем OPC, полученные из MESC, трансдуцируют вирусами bao, несущими субъединицу NAV 1.2, для создания спайковых OPC; в результате с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии и электрофизиологических записей подтверждается экспрессия маркера OPC и наличие спайковых свойств у этих полученных из MESC OBC. Здравствуйте, я Понг Чианг из лаборатории доктора Инга на кафедре клеточной биологии и анатомии человека Калифорнийского университета в Дейвисе. Мы также сотрудничаем с Детской больницей Шрайнера в Северной Калифорнии.

Здравствуйте, я Виал Радж, также из лаборатории Денга. Сегодня мы продемонстрируем вам процедуру дифференцировки эмбриональных стволовых клеток мыши в предшественники глии. Мы используем эту процедуру в нашей лаборатории для изучения свойств предшественников олигодендроцитов, полученных из эмбриональных стволовых клеток, с целью создания клеток с более высоким терапевтическим потенциалом.

Итак, приступим. Сегодня мы будем получать клетки-предшественники олигодендроцитов или OPC из линии эмбриональных стволовых клеток мыши OG2-GFP. Эти эмбриональные стволовые клетки необходимо пересевать каждые три дня, чтобы поддерживать их жизнеспособность при оптимальной плотности и предотвращать спонтанную дифференцировку. Пересадка.

Клетки ESS при достижении 70% конфлюэнтности в ламинарном шкафу. Удалите среду с культуры. Промойте PBS и обработайте трипсином, добавив два миллилитра предварительно нагретого раствора.

Перемешивайте одну раз в течение пяти минут при 37 °C. Остановите реакцию и ресуспендируйте клетки в 4 мл среды для клеток MES. Перенесите клетки в коническую пробирку объемом 15 мл и осадите их центрифугированием при 1000 об/мин в течение пяти минут.

Перевзвесьте в чашке с культуральной средой MESL одну десятую часть клеток поверх сплойного слоя облученных фидерных клеток мыши в среде для клеток MES. Через три дня ЭСК достигают примерно 70% конфлюэнтности и готовы к пассированию или суспендированию для формирования эмбриональных телец с целью их индукции и начала дифференцировки. Обработайте колонии ЭСК мыши трипсином, как описано ранее, а затем перевзвесьте клетки в среде с заменителем сыворотки KnockOut или среде KSR. Подсчитате количество клеток с помощью гемоцитометра, затем разбавьте суспензию в KSR.

Расположите среду с концентрацией 15 000 клеток на мл, добавив по 3 мл в каждую лунку 6-луночного планшета с ультранизкой адгезией. Культивируйте суспендированные клетки при 37 °C в течение четырех дней. Полностью заменяйте среду каждые два дня.

Начиная с четвертого дня, ежедневно заменяйте среду; на четвертый день добавьте в KSR 0,2 мкМ ретиноевой кислоты; на пятый день добавьте как ретиноевую кислоту, так и 1 мкМ примоморфамина; на шестой и седьмой дни повторите добавление. Культивируйте эмбриональные тельца в двух средах, дополненных 0,2 мкМ ретиноевой кислоты и 1 мкМ примоморфамина. После восьми дней культивирования большинство эмбриональных тельца экспрессируют GFP и готовы к дизагрегации трипсином; подсчитайте количество клеток, как и раньше.

Затем ресуспендируйте их до концентрации 3,5 × 10⁵ клеток на мл. В среду OPC добавьте три миллилитра суспензии в среде OPC. Используя 60-миллиметровые чашки, покрытые полиорнитином, примерно каждую неделю клетки будут достигать конфлюэнтности и выглядеть следующим образом; проведите пассирование клеток, как и раньше, с трехминутной трипсинизацией.

Через 30 дней после первоначального суспендирования. В среде KSR клетки проявляют характеристики клеток-предшественников олигодендроцитов для генерации спайковых OPC. Используйте OPC, полученные из ESL мыши, при слиянии от 50 до 70%.

Замените среду на XPBS для промывки клеток. Для введения вольтаж-зависимого натриевого канала 1.2, альфа-субъединицы.

Мы используем набор для исследования натриевых каналов back MAM. Смешайте 1 mL компонента A набора back MAM с 4 mL 1X PBS. Удалите промывочный раствор PBS и добавьте разведенный компонент.

Инкубируйте при 37 °C в течение двух часов. Замените агент памяти с обратной связью на среду OPC, дополненную компонентами B и C, согласно описанию в наборе. Инкубируйте еще два часа при 37 °C.

После инкубации замените обогащенную среду на свежую среду для OPC. После еще 24 часов культивирования можно провести анализ полученных из ESL OPC на наличие спайкинга в данной временной точке. EBS не проявляют GFP-флуоресценции.

EBS демонстрируют сильную экспрессию GFP и готовы к культивированию методом дезагрегации примерно через 30 дней после исходного суспендирования. В среде KSR большинство клеток иммуноположительны при окрашивании на NG2, что согласуется с экспрессией GFP. Однако, в отличие от OPC головного мозга, эти OPC, производные от клеток MES, не способны генерировать потенциалы действия даже при деполяризации клеток до 0 мВ.

После введения субъединицы NAV 1.2 посредством вирусной трансдукции эти полученные из клеток MES ОПЦ возбуждаются и генерируют потенциалы действия. Мы только что продемонстрировали вам, как дифференцировать эмбриональные стволовые клетки мыши в ОПЦ и создавать спайковые ОПЦ с помощью вирусной трансдукции. При выполнении данной процедуры важно помнить о правильном хранении ретиноевой кислоты, морфина и FGF 2, всегда использовать свежие аликвоты и утилизировать излишки ретиноевой кислоты после использования.

На этом всё. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.