Изоляция стволовых клеток из мягких тканей опорно-двигательного

Общая цель данной процедуры заключается в выделении взрослых стволовых клеток из мягких тканей опорно-двигательного аппарата, таких как скелетные мышцы. Это достигается путем взятия биопсии мягкой ткани с последующим удалением омертвевших тканей и ее тщательным измельчением. Вторым этапом процедуры является ферментативное переваривание ткани.

Третьим этапом процедуры является выделение стволовых клеток посредством многократного предварительного посева. Заключительным этапом процедуры является идентификация выделенных стволовых клеток. В конечном итоге можно получить результаты, демонстрирующие морфологические и клеточные особенности клеток с помощью иммунофлуоресценции, микроскопии и/или проточной цитометрии.

Здравствуйте, я Ли из лаборатории молекулярной патологии отделения ортопедической хирургии Питтсбургского университета. Сегодня я покажу вам, как выделить взрослые стволовые клетки из мягких тканей опорно-двигательного аппарата, например, из скелетных мышц. Здравствуйте, я доктор Джонни Уорд.

Я профессор медицинского факультета Университета Питтсбурга на кафедре ортопедической хирургии. Я тесно сотрудничаю с доктором Янгом Ли над процедурами выделения различных типов стволовых клеток из скелетных мышц и других тканей, таких как стандартные ткани. Мы используем эти процедуры в нашей лаборатории для выделения стволовых клеток, в основном для исследовательских работ по применению в трансляционной медицине.

Приступим к изучению. В качестве тканей, из которых могут быть выделены стволовые клетки, можно использовать сухожилия и скелетные мышцы, взятые из большеберцовой или камбаловидной мышц задней конечности мышей дикого типа. После удаления остатков кожи и кости поместите ткани в чашку с холодным раствором HBSS, дополненным 5% FBS.

Затем поместите ткани по отдельности в чашки с коллагеновым покрытием, содержащие холодный HBSS. Для демонстрации основных процедур диссоциации и переваривания тканей мы будем использовать ткани скелетных мышц. С помощью микроножниц и/или лезвий скальпеля измельчите ткани скелетных мышц до состояния грубой кашицы для последующего ферментативного переваривания тканей.

Начните с переноса суспензий тканей MIT в отдельные пробирки объемом 15 миллилитров; центрифугируйте при температуре четырех градусов Цельсия примерно 5 000 об/мин в течение пяти минут. Удалите промывочный раствор SANE, ресуспендируйте осадок в HBSS и повторите центрифугирование. После удаления супернатанта проведите переваривание суспензий, добавив 10 миллилитров предварительно нагретого 0,2% коллагеназы.

Образцы типа 11 инкубируют в течение 60 минут при 37 °C, каждые 10 минут встряхивая пробирки вручную. По завершении 60-минутной инкубации центрифугируют, затем ресуспендируют суспензии в 10 мл раствора DYS space. Инкубируют в течение 45 минут при 37 °C, каждые 10 минут встряхивая вручную; по завершении 45-минутной инкубации центрифугируют и ресуспендируют суспензии в 10 мл 0,2% раствора трипсина в HBSS.

Обычно инкубацию проводят в течение 15–20 минут при 37 °C, переворачивая пробирки каждые 10 минут, после чего инкубация завершается. Когда из тканей высвобождается достаточное количество одиночных клеток, как показано здесь, полученную суспензию центрифугируют и ресуспендируют осадок клеток в 5 мл пролиферационной среды PM. Диспергируют клеточную суспензию, пропуская экстракт дважды через иглу калибра 18G, затем один раз через иглу калибра 23G и, наконец, один раз через иглу калибра 27G.

Наконец, пропустите экстракт клеток через клеточный фильтр с размером пор 70 микрон для начала метода prepl. Центрифугируйте только что подготовленный экстракт клеток и ресуспендируйте осадок в пролиферационной среде. Перенесите 5 мл клеточной смеси в T 25 флакон с коллагеновым покрытием и пометьте его как PP1; инкубируйте при 37 °C в увлажненном инкубаторе с 5% CO2 в течение двух часов.

Через два часа перенесите неадгезивные клетки в новый T 25 флакон с коллагеновым покрытием и обозначьте его как PP two. В предыдущий флакон T 25, обозначенный как PP one, добавьте 5 mL PM.

Поместите обе колбы обратно в инкубатор на 24 часа. Через 24 часа перенесите нефракционированные (неадгезивные) клетки из колбы PP two в новую колбу T 25, покрытую коллагеном ENC, и обозначьте её как PP three. Добавьте пять миллилитров пролиферационной среды в колбу с надписью PP two.

Верните колбы в инкубатор. Повторяйте процедуру каждые 24 hours до достижения популяции PP six. Популяция стволовых клеток создана.

Количество изолированных клеток PP six очень мало, поэтому их необходимо поддерживать в пролиферационной среде, богатой FBS. Среду следует менять ежедневно. При этом большинство клеток в культуре PP six погибнут в течение следующих одной-двух недель культивирования.

Крупная здоровая популяция PP six обычно создается после дополнительного расширения в течение одной или двух недель. Также следует поддерживать все остальные группы суспендированных клеток, обеспечивая их пролиферацию и регулярно исследуя их с помощью инвертированного микроскопа. Первыми адгезирующими клетками, прикрепляющимися к колбам PP one и PP two, являются преимущественно фиброзные клетки.

Клетки, которые прикрепляются к коллаген-покрытым флаконам через более длительный период времени, от 48 до 96 часов. PP3 и PP4 состоят преимущественно из миобластов. В то время как сателлитные клетки мышц чаще всего наблюдаются в PP5, более поздние преплаковые клетки (96 часов или позже, PP6) рассматриваются как взрослые стволовые клетки и выглядят маленькими, округлыми и прозрачными.

В начале процесса изоляции их можно дополнительно охарактеризовать с помощью иммуногистохимического анализа на экспрессию маркеров стволовых клеток, таких как антиген стволовых клеток 1 и CDC 34. Мы только что продемонстрировали вам способ изоляции стволовых клеток из костного мозга мыши. При выполнении этой процедуры важно помнить о необходимости соблюдения стерильности на всех этапах.

После выделения стволовых клеток обязательно культивируйте их при низкой плотности, чтобы сохранить их характеристики. На этом всё. Спасибо за просмотр, и удачи в вашей работе. Желаю вам успехов в применении этого метода в вашем эксперименте.

Спасибо.