Человеческий Т-лимфоцитов изоляции, культуры и анализ миграции In Vitro

Миграция T-лимфоцитов происходит во время хоминга в лимфоидные органы, выхода из сосудистого русла и проникновения в периферические ткани. Этот процесс включает адгезивное взаимодействие поверхности T-клеток с другими клетми. Чтобы изучить данное явление in vitro, T-лимфоциты человека изолируют, культивируют и помещают на планшеты для культивирования тканей, покрытые адгезивным белком.

ICAM-1 и хемокин SDF-1. Затем можно получить и проанализировать изображения миграции T-лимфоцитов. Здравствуйте, я Крейг ЛеФорт из лаборатории Минсу Ким в Центре биологии вакцин и иммунологии при Университете Рочестера.

Сегодня мы продемонстрируем процедуру выделения и культивирования Т-лимфоцитов человека, а также анализ их миграции in vitro. Мы используем этот метод в нашей лаборатории для изучения роли интегринов и миграции Т-клеток. Основным интегрином в Т-клетках является антиген, ассоциированный с функцией лимфоцитов-1, или LFA-1.

Специфическими лигандами для LFA-1 являются молекулы семейства ICAM, такие как ICAM-1. Кроме того, для миграции T-клеток необходим хемокиновый сигнал, который обеспечивает как сигнал направленности, так и активацию интегринов. В нашем анализе мы используем человеческий ICAM-1 и CXCL12 (SDF-1) в качестве субстратов для миграции T-клеток.

Итак, приступим. После получения крови человека от здорового донора дайте ей остыть до комнатной температуры. Это занимает около 30 минут.

После охлаждения крови осторожно перенесите пипеткой 3 mL среды для градиентного центрифугирования полиморфных клеток комнатной температуры в полистирольную пробирку с круглым дном объемом 8 mL. Затем аккуратно добавьте сверху 3 mL цельной крови. Важно избегать перемешивания слоев.

Поместите пробирки в центрифугу и центрифугируйте при 500 G в течение 45 минут. После центрифугирования при комнатной температуре мононуклеарные клетки периферической крови или PBMC отделяются от остальных компонентов крови. Слой PBMC выглядит как первая мутная полоса сверху.

В стерильных условиях осторожно удалите и утилизируйте верхнюю прозрачную фазу желтого цвета. Затем с помощью микропипетки P 1000 перенесите слой PBMC в новую коническую пробирку. Дважды промойте PBMC с помощью PBS, центрифугируя клетки при 500 G в течение пяти минут.

После каждой промывки супернатант будет оставаться в некоторой степени мутным. Ресуспендируйте клетки в 20 миллилитрах среды RPMI 1640, содержащей 10% FBS, 1% пенициллина-стрептомицина и один микрограмм на миллилитр фитогемагглютинина или PHA. Инкубация в присутствии PHA индуцирует активацию и экспансию T-лимфоцитов.

С помощью пипетки перенесите PBMC в культуральный флакон T 75. Затем инкубируйте при 37 °C и 5% CO2 от 1 до 24 часов. Этот этап позволяет отделить моноциты, которые прикрепляются к поверхности флакона, от лимфоцитов, остающихся в суспензии.

После инкубации осторожно удалите всю среду, содержащую преимущественно лимфоциты, и перенесите ее в коническую пробирку объемом 15 мл. Центрифугируйте при 500 G в течение пяти минут. Ресуспендируйте осадок клеток в RPMI 1640 и перенесите клетки в новый флакон T 75, содержащий 25 мл RPMI 1640 с FBS, пенициллином, стрептомицином и PHA, при инкубации при 37 °C.

После 24 часов роста может потребоваться добавить от 15 до 20 мл свежей среды и перенести культуру в более крупный флакон T 175. Продолжите инкубацию в течение двух или трех дней. Если первоначальная инкубация PBMC проходила в течение ночи, то спустя три дня с помощью пипетки удалите среду, содержащую суспендированные лимфоциты, и перенесите ее в коническую центрифужную пробирку объемом 50 мл, затем центрифугируйте при 500 G в течение пяти минут.

Риз собрал осадок клеток и перенес клетки в новый флакон T 75, содержащий 25 миллилитров RPMI 1640 с FBS, пенициллином, стрептомицином и человеческим IL 2 или IL 15, после чего поместил клетки в инкубатор. При использовании флакона T 75 культуру потребуется экспандировать и перенести во флакон T 175.

После одного-двух дней культивируйте лимфоциты в общей сложности от четырех до семи дней. За один день до проведения анализа миграции покройте чашку с стеклянным дном 0,17 мм 20 µg/mL протеина A или G в PBS и инкубируйте её в течение ночи при 4 °C. На следующий день тщательно промойте чашку раствором PBS, затем добавьте в чашку раствор ICAM-1 FC и человеческого SDF-1 в PBS.

Инкубируйте в течение четырех часов при комнатной температуре для иммобилизации молекул. Определите плотность культивируемых клеток с помощью гемоцитометра. Затем дважды промойте лимфоциты раствором PBS и ресуспендируйте их в одном миллилитре среды L 15, содержащей D-глюкозу. После инкубации тщательно промойте покрытое блюдо с ICAM-1 FC и SDF-1 раствором PBS, затем перенесите Т-лимфоциты в одном миллилитре среды в блюдо; для достижения плотности клеток, подходящей для анализа миграции, на одно блюдо следует использовать примерно от 2 до 5 × 10⁵ клеток.

Для получения изображений миграции клеток поместите чашку на предметный столик микроскопа в контролируемую по температуре среду, например, в термостат при 37 °C. Откройте программное обеспечение NIS elements и перейдите в меню настроек изображения. Выберите режим биннинга 2х2 как для режима живого наблюдения, так и для захвата изображений.

Перейдите в меню приложений и выберите «define, run, experiment». Установите интервал между снимками и общее время наблюдения. Чтобы запустить последовательность захвата изображений, нажмите кнопку запуска для начала сбора данных согласно заданным параметрам.

Параметры миграции, такие как скорость, длина пути и смещение, могут быть количественно определены с помощью такого программного пакета, как Image J Auto Quant или veloc. Для построения диаграммы «паутины» соберите XY-координаты для каждой клетки в каждой временной точке и спроецируйте их на график, где общая начальная точка для каждой клетки находится в начале координат. T-лимфоциты, показанные здесь, культивировались на подложке с ICAM и SDF-1; съемка изображений проводилась каждые 10 секунд в течение 30 минут.

В данном видео показана случайная миграция T-лимфоцитов со скоростью приблизительно 15 мкм/мин с использованием координат XYT для каждой клетки. 15 клеток были выбраны случайным образом и отображены с общим начальным пунктом в начале координат. Сравнение паутинообразных графиков позволяет быстро визуально оценить различия в миграции при разных экспериментальных условиях.

Графики миграции Т-лимфоцитов в контрольных условиях показаны слева, а графики миграции Т-лимфоцитов в присутствии блокирующих антител к лиганду LFA one — справа. Эти данные демонстрируют, что Т-лимфоциты используют интегрин LFA one для миграции по субстрату ICAM one. Мы только что продемонстрировали вам, как проводить анализ миграции с использованием культивируемых Т-лимфоцитов человека в ходе данной процедуры.

Важно помнить о добавлении соответствующего количества клеток в планшет с покрытием ICAM-1, чтобы упростить отслеживание клеток и анализ их миграции. На этом всё. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.