Обратный генетический подход для тестирования функциональной избыточностью во время эмбриогенеза

Общая цель данной процедуры — определить, являются ли два гена функционально избыточными для спецификации определенной клеточной линии. Это достигается путем первоначального определения фенотипа потери функции каждого отдельного гена с использованием ген-специфичных морфолино, введенных в развивающиеся эмбрионы данио-рерио. Вторым этапом процедуры является разработка метода количественной оценки спецификации или дифференцировки клеточной линии.

Например, с использованием репортерной линии рыб, что мы и продемонстрируем далее. Третьим этапом процедуры является объединение двух морфолино-FENO для одновременного подавления функций обоих генов. Заключительным этапом процедуры является оценка фенотипа, вызванного двойным нокдауном.

В конечном итоге можно получить результаты, демонстрирующие потерю или приобретение функции клеток определенной линии путем изучения репортера линии или анализа экспрессии специфического маркера линии. Основным преимуществом данной методики перед существующими методами, такими как комбинирование нокаутов в мышиных моделях, является то, что в модели рыб можно воздействовать на два или даже три гена, просто объединив проверенные морфолино в одном эксперименте. Можно инъецировать более 100 эмбрионов и оценивать фенотипы в течение нескольких дней.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы. В биологии развития, например, при определении транскрипционных путей, контролирующих судьбу клеток, основные регуляторные пути часто представлены небольшими семействами родственных генов с функциональным резервированием. Поэтому их роль не всегда очевидна из исследований по нокауту генов у мышей из-за компенсации со стороны сестринских генов.

Хотя данная модель позволяет изучить эмбриогенез данио-рерио, полученные результаты могут быть применимы и к другим системам, например, к мышам, поскольку одни и те же генетические программы обычно хорошо консервируются в ходе эволюции. Перед инъекцией в эмбрионы подготовьте планшеты для микроинъекций. Налейте примерно 12 миллилитров 2% агарозы в системной воде (чистая вода, взятая непосредственно из системы аквариумов) в перевернутую крышку чашки Петри диаметром 100 миллиметров.

Установите два предметных стекла под углом примерно 45 градусов в две стороны крышки. После затвердевания агарозы осторожно выньте стекла из-под крышки, чтобы образовались желобки, в которых будут находиться эмбрионы во время инъекции морфолино. Запасы морфолино хранят при комнатной температуре в концентрации 1 мМ в стерильной дистиллированной деионизированной воде перед инъекцией. Инкубируйте запасы морфолино при 65 °C в течение пяти минут, чтобы обеспечить их полное растворение.

Дайте стоковым растворам остыть до комнатной температуры. Каждый вновь разработанный морфолино должен пройти эмпирическую валидацию на активность и переносимость эмбрионом. В микроцентрифужных пробирках выполните одно- или двухкратное серийное разведение стокового раствора морфолино в дистиллированной деионизированной воде для получения рабочих концентраций 1 mM, 0,5 mM, 0,25 mM и 0,125 mM.

Под бинокулярным микроскопом с помощью вакуумного аспиратора заполните с переднего конца калиброванную инъекционную иглу, закрепленную на микроманипуляторе и правильно позиционированную. Заполните иглу примерно 1 µL раствора morpho самой низкой концентрации. С помощью переносной пипетки перенесите оплодотворенные одноклеточные эмбрионы в лунки планшета для микроинъекций.

С помощью пипетки удалите из лунки излишки воды, чтобы эмбрионы осели на дно. Поместите планшет для инъекций под микроскоп, пропустите иглу сквозь хорион в желточный мешок. Выполните инъекцию в каждый эмбрион, после чего извлеките иглу и переместите планшет для доступа к следующему эмбриону.

При обучении инъекциям может быть полезно использовать витальный краситель для визуализации введения вещества в клетку, как показано здесь; затем перенесите эмбрионы обратно в чашку Петри диаметром 100 мм с системной водой и культивируйте их при температуре 28.5 °C. Выдавите остатки раствора морфолино в избытке из иглы и заполните ее раствором морфолино следующей, более высокой концентрации для инъекций в следующую группу эмбрионов на соответствующей стадии развития. Оцените фенотипы эмбрионов при каждой использованной концентрации морфолино.

Пороговая доза для каждого морфолино не является самой низкой дозой, при которой наблюдается определенный надежный фенотип. Для точного определения порога может потребоваться несколько раундов титрования. Это позволяет выявить генетическое взаимодействие между двумя различными генами.

Приготовьте смесь двух интересующих морфолино в соответствующих пороговых концентрациях. Важно помнить, что эмбрионы могут не перенести более 20 nanograms суммарного количества морфолино на одну инъекцию. Выполните инъекции эмбрионов таким же образом, как и ранее.

Соблюдайте постоянство объемов инъекций в экспериментальной и контрольных группах; последние должны включать наборы, в которые под диссекционным микроскопом вводили только отдельные морфолино. Контролируйте состояние инъецированных эмбрионов сразу после процедуры и несколько раз в течение дня, используя переносящую пипетку для удаления любых погибших или погибающих эмбрионов. Поскольку такие эмбрионы могут снизить жизнеспособность оставшихся, с помощью переносящей пипетки удаляйте заторможенных или эвтаназированных эмбрионов в любое время.

Поместите образец на предметное стекло с лункой для наблюдения. Для фотографирования. При необходимости используйте острый пинцет, чтобы удалить хорион.

Стабилизируйте эмбрион в капле 3% метилцеллюлозы; отберите эмбрионы с выраженным фенотипом, характерным именно для комбинации морфолино, а не просто с повышенной пенетрантностью фенотипа отдельных морфолино. Перед вами несколько эмбрионов дикого типа после инъекции морфолино в пороговых дозах. Для gata5 типичным фенотипом является cardio bifida (двусердечие), возникающее из-за того, что клетки-предшественники не слились по срединной линии.

Обратите внимание на GFP-положительные кардиомиоциты, указанные стрелками. Фенотип шести морфинтов включает сердце неправильной формы, которое не подвергается надлежащему изгибу. У этих эмбрионов также развиваются GFP-положительные кардиомиоциты.

Однако эмбрионы, которым была введена комбинация морфолино к gata five и gata six, показанные здесь, демонстрируют полную потерю развития кардиомиоцитов, что указывает на необходимость экспрессии либо gata five, либо gata six для развития кардиомиоцитов. Эти два гена функционально избыточны для спецификации кардиомиоцитов.

При выполнении данной процедуры важно сначала полностью валидировать ваши морфолино, чтобы максимально убедиться в том, что они обеспечивают истинный нокдаун одного целевого гена при соблюдении данного протокола. Для подтверждения функций тех же генов, в том числе у млекопитающих, могут быть использованы другие методы, например, сочетание условных нулевых аллелей у мышей.

После просмотра видео вы должны будете четко понимать, как определить, являются ли два гена функционально избыточными в процессе эмбриогенеза.