Децеллюляризация жировых пакетов молочных желез: получение гидрогелей с внеклеточным матриксом из жировых пакетов молочных желез

Сначала поместите жировые пакеты молочных желез или МФУ в чашку с раствором Trypsin-EDTA и инкубируйте в течение желаемого времени, чтобы разорвать спайки клеточного матрикса. Промойте МФУ деионизированной водой и процедите через ситечко. Поместите салфетки в стакан с перемешивателем и добавьте Triton X-100. Перемешайте для лизиса клеток, не влияя на факторы роста во внеклеточном матриксе ткани.

Процедите МФУ и промойте деионизированной водой. Перенесите ткани обратно в стакан и добавьте дезоксихолевую кислоту для лизирования оставшихся клеток. Затем процедите МФУ и поместите в стакан с деионизированной водой с пенициллин-стрептомицином, чтобы предотвратить загрязнение. Инкубируйте стакан при температуре 4 градуса Цельсия на ночь.

Процедите МФУ и поместите их в стакан, содержащий этанол и надуксусную кислоту. Надуксусная кислота увеличивает жесткость внеклеточного матрикса ткани. Помешивайте некоторое время и повторите шаг процеживания. Промойте МФУ PBS, а затем деионизированной водой. Переложите процеженные МФУ в стакан, содержащий пропан-1-ол.

Некоторое время перемешайте, процедите содержимое и промойте МФУ деионизированной водой. Высушите МФУ и храните при температуре минус 80 градусов Цельсия. В следующем протоколе мы выполним децеллюляризацию мышиных жировых пакетов молочной железы.

Сначала поместите МФУ в шестисантиметровую посуду с пятью миллилитрами раствора Трипсин-ЭДТА. Распылите и протрите посуду 70% этанолом и выдерживайте при температуре 37 градусов Цельсия в течение часа. Используйте фильтры 0,7 миллиметра для промывки МФУ деионизированной водой, трижды облив ткань водой. Используйте щипцы для ручного массажа ткани между мытьем.

Далее кратко просушите ткань на деликатной рабочей салфетке и взвесьте ее. Поместите высушенные салфетки в предварительно автоклавный стакан, содержащий мешалку соответствующего размера, и покройте салфетки 60 миллилитрами 3% t-октилфеноксиполиэтоксиэтанола на грамм ткани. Помешивайте в течение часа при комнатной температуре. Затем слейте содержимое стаканов в ситечко.

Промойте стакан деионизированной водой и вылейте ее на салфетки. Повторите этот процесс полоскания еще два раза, используя щипцы для ручного массажа ткани между полосканиями. После этого кратко просушите ткань на деликатной работе, протрите и взвесьте. Поместите салфетки и батончики обратно в те же стаканы и покройте их 60 миллилитрами 4% дезоксихолевой кислоты на грамм ткани. Помешивайте при комнатной температуре в течение часа.

Затем высыпьте содержимое стакана в сетчатое ситечко. Промойте стакан деионизированной водой и вылейте ее на салфетки. Повторите этот процесс полоскания еще два раза, используя щипцы для ручного массажа ткани между полосканиями. Быстро просушите прополоспанную ткань на деликатной рабочей салфетке и взвесьте ее.

Поместите высушенные ткани в тот же стакан вместе со свежей деионизированной водой с добавлением 1% пенициллина стрептомицина. Плотно накройте стакан парафиновой пленкой и оставьте при температуре 4 градуса Цельсия на ночь. На следующий день слейте содержимое стакана в ситечко. Ненадолго просушите ткань на деликатной рабочей поверхности, протрите и взвесьте ее. Затем поместите МФУ в ту же мензурку с мешалкой соответствующего размера.

Покрыть ткань 60 миллилитрами раствора, содержащего 4% этанола и 0,1% надуксусной кислоты на грамм ткани. Помешивайте при комнатной температуре в течение двух часов. Вылейте содержимое стакана в ситечко толщиной 0,7 миллиметра. С помощью щипцов вручную помассируйте ткань и поместите содержимое обратно в стакан. Промойте салфетку, накрыв ее 60 миллилитрами 1X PBS на грамм ткани.

Помешивайте при комнатной температуре в течение 15 минут. Повторите весь этот процесс стирки еще раз. Далее высыпьте содержимое стакана в ситечко толщиной 0,7 миллиметра. С помощью щипцов вручную массируйте ткань и поместите содержимое обратно в стакан. Промойте салфетку, покрыв ее 60 миллилитрами деионизированной воды на грамм ткани.

Помешивайте при комнатной температуре в течение 15 минут. Повторите весь этот процесс стирки еще раз. Коротко просушите выстиранную салфетку на деликатной рабочей салфетке и взвесьте ее. Свалите салфетку и содержимое в ситечко и с помощью щипцов вручную массируйте ткань. Поместите содержимое обратно в стакан и покройте ткани 60 миллилитрами 100% n-пропанола на грамм ткани.

Помешивайте при комнатной температуре в течение часа. Затем кратко просушите ткань на деликатной рабочей салфетке и взвесьте ее. Свалите салфетку и содержимое в ситечко толщиной 0,7 миллиметра и с помощью щипцов вручную массируйте ткань. Поместите содержимое обратно в стакан и промойте ткань, покрыв ее 60 миллилитрами деионизированной воды на грамм ткани.

Помешивайте при комнатной температуре в течение 15 минут. Повторите этот процесс стирки три раза. После этого ненадолго просушите ткань на деликатной для работы салфетке и взвесьте ее. Перенесите ткань в промаркированную 15-миллилитровую пробирку и заморозьте при температуре минус 80 градусов Цельсия на ночь.