Сравнительный В естественных условиях Изучение иммуногенности gp96 в Лягушка Xenopus laevis

Общая цель данной процедуры — изучить эволюционную сохранность способности белка теплового шока GP96 стимулировать антигенспецифический ответ CD8+ Т-клеток у лягушки Xenopus laevis. Для этого сначала проводят сбор лейкоцитов брюшины с помощью перитонеального промывания. Вторым этапом процедуры является пульсация лейкоцитов брюшины опухолевым GP96, который выступает в роли шаперона минорных и опухолевых антигенов, после проведения инкубации и промывок.

Перитонеальные лейкоциты переносятся путем внутрибрюшинной инъекции наивным лягушкам для создания иммунного ответа к опухолевым или малым антигенам гистосовместимости. Третий этап процедуры заключается в проведении пересадки кожи или введении опухолевых клеток праймированным лягушкам с последующим мониторингом начала отторжения кожного трансплантата или появления опухоли. Заключительный этап процедуры состоит в заборе периферической крови для характеристики T-клеток, участвующих в реакциях отторжения кожи и противоопухолевом ответе.

В конечном итоге можно получить результаты, демонстрирующие значительное ускорение отторжения кожного трансплантата, а также задержку появления опухоли у лягушек, праймированных GP 96, в ходе анализов по пересадке кожи и введению опухолевых клеток соответственно. Здравствуйте, я Кристина Коска из лаборатории доктора Жака Роберта на кафедре микробиологии и иммунологии Медицинского центра университета Рочестера. Я Таня Крус, также из лаборатории доктора Риверса.

Сегодня мы продемонстрируем процедуру праймирования клонированных лягушек путем адаптивного переноса лейкоцитов брюшины с последующим проведением тестов по пересадке кожи и трансплантации опухолей. Кроме того, мы покажем, как осуществлять забор периферической крови у этих животных. В нашей лаборатории мы используем данную процедуру для изучения способности белка теплового шока GP 96 стимулировать антигенспецифические CD4+ T-клетки у Xenopus, а также для исследования типов вовлеченных клеток.

Итак, приступим. Лягушки, используемые в наших экспериментах, представляют собой изогенные клоны из нашей племенной колонии в Университете Рочестера. Чтобы вызвать приток лейкоцитов брюшины (pls) для последующего сбора, используйте иглу калибра 25G длиной 5/8 дюйма для внутрибрюшинного введения обезьянённой лягушке препарата из термоинактивированных E. coli. Через три дня после инъекции лейкоциты брюшины собирают путем внутрибрюшинного лаважа.

Для начала процедуры продезинфицируйте брюшную полость анестезированной лягушки небольшим количеством 70% ethanol. Затем с помощью иглы калибра 18 (размером 1,5) введите пять миллилитров стерильного фосфатно-солевого буфера для амфибий или PBS, предварительно нагретого до комнатной температуры, в брюшную полость. Извлеките иглу и осторожно массируйте лягушку в течение одной минуты, чтобы введенный буфер равномерно распределился в жидкости в полости тела.

Затем введите в брюшную полость лягушки новую иглу 18 G длиной 1,5 без шприца. Избегая повреждения кровеносных сосудов, соберите перитонеальную жидкость, которая будет стекать с задней части иглы в чистую коническую пробирку объемом 50 миллилитров. Убедитесь, что после сбора pls вы извлекли максимально возможный объем изначально введенного раствора.

Поместите лягушку в контейнер с неглубокой водой до её пробуждения, после чего её можно будет вернуть в клетку. После сбора pls центрифугируйте пробу при 1000 RPM в течение 10 минут при температуре четырех градусов Celsius, удалите sup, natant и resus. Суспендируйте pls в холодном A PBS.

Перенесите РЕСУСПЕНДИРОВАННЫЕ pls в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра. Для пульсации PLS с GP 96. Добавьте соответствующее количество GP 96 к pls и перемешайте путем пипетирования; инкубируйте на льду в течение одного часа, после одного часа.

Центрифугируйте клетки при 14, 000 RPM в течение одной минуты. Чтобы удалить несвязанный GP 96, слейте супернатант. Добавьте холодный A PBS и ресуспендируйте.

Снова центрифугируйте PLS. Промойте S холодным A-P-B-S-A в общей сложности три раза, чтобы после финальной промывки не осталось остаточного G 96. Ресуспендируйте импульсно обработанные pls в концентрации 5 × 10⁵ pls на 300 µL PBS для адаптивного переноса pls наивным реципиентам LG six.

Внутрибрюшинно введите 300 µL импульсного pls каждому животному. Подготовка лягушек должна быть проведена не менее чем за три дня до экспериментов по пересадке кожи или введению опухолевых клеток, которые будут показаны далее. Кожу для трансплантации получают от донорской лягушки LG 15 под общей анестезией.

С помощью ножниц вырежьте и удалите небольшой фрагмент вентральной кожи — это кожа в области живота, имеющая серебристый оттенок. Из-за наличия ARI избегайте воздействия на четыре пигментированные клетки при работе с трансплантатом. Крайне важно максимально ограничить манипуляции с тканью, так как это может привести к повреждению трансплантата.

Осторожно удерживайте кожу пинцетом и перенесите ее в чашку Петри с холодным A PBS. Держите чашку Петри открытой. Поместите кожу на чистый предметное стекло и с помощью лезвия разрежьте отдельные трансплантаты на фрагменты размером 5 мм на 5 мм.

Храните фрагменты в PBS на льду до пересадки кожи на лягушку-реципиента LG six. Сначала сделайте небольшой разрез на спинной стороне кожи анестезированного реципиента. Затем введите трансплантат размером 5 мм на 5 мм под кожу серебристой стороной вверх.

Обязательно отметьте следы от ножниц и пинцета на трансплантатах, так как они не считаются признаками отторжения трансплантата. Когда через 24 часа начнется оценка, необходимо удалить часть перекрывающей кожи реципиента с трансплантата. Используйте ножницы, чтобы вырезать «окно» вокруг трансплантата, чтобы обеспечить свободный визуальный доступ к нему.

Будьте осторожны, чтобы не касаться донорской кожи и не вызвать кровотечение. Сразу приступайте к разметке трансплантата, сделав набросок. Кожный трансплантат.

Отторжение определяется процентом разрушения аридола на трансплантированной коже. Состояние трансплантата следует проверять каждые два-три дня с помощью стереомикроскопа. Подготовьте опухолевые клетки для трансплантации, суспендировав их в среде для культивирования опухоли с плотностью 5 × 10⁵ клеток на 300 µL.

Пересадите клетки путем подкожной инъекции в одну сторону на дорсальной поверхности животного. Каждой лягушке вводят 5 × 10⁵ клеток в объеме 300 µL. Рост опухоли начнется в течение двух-трех недель после индукции опухоли.

Отметьте первоначальный вид опухоли. Используйте штангенциркуль для измерения размеров опухоли и фиксируйте ее объем каждые два-три дня до сбора лейкоцитов крови лягушки. Подготовьте стеклянные иглы, вытянув паста-пипетки над пламенем.

После затачивания тонкого конца пипетки под стереомикроскопом подсоедините пипетку к пластиковой трубке для аспирации. Чтобы начать забор крови, сделайте разрез кожи над задней лапкой анестезированной лягушки, чтобы обнажить дорсальную вену предплюсны. Заполните стеклянную иглу от одного до двух миллилитров ледяного раствора A PBS с гепарином.

Затем введите стеклянную иглу в вену и начните сбор крови, медленно аспирируя ее ртом. Из одной лягушки среднего размера можно получить от одного до двух миллилитров крови. Небольшой разрез на ноге лягушки зашивать не требуется.

Рана заживет в течение недели. Здесь представлены результаты стереомикроскопического анализа отторжения кожного трансплантата через 12 дней после трансплантации. У клонированной лягушки LG six, получившей кожный трансплантат от донора LG six с идентичным MHC, отторжения не наблюдалось.

Звездочка указывает на маркерный пинцет, не связанный с отторжением. Напротив, у клонированной лягушки LG six, получившей трансплантат кожи от генетически разнородного донора с несоответствием по MHC, наблюдается 80% отторжения. На обоих изображениях стрелки указывают на серебристые иридофоры (пигментированные клетки), отмечающие здоровую, не отторгнутую трансплантированную ткань.

В следующем эксперименте лейкоциты (PLS) LG 15 подвергали импульсной стимуляции либо PBS в качестве отрицательного контроля, либо рекомбинантным GP 96, очищенным из культуры e coli, либо GP 96, очищенным из клеток опухолевой ткани 15 zero. Затем эти клетки адаптивно переносили взрослым реципиентам LG 15, и через три дня путем подкожной инъекции трансплантировали живые опухолевые клетки 15 zero. Опухоли, впервые появившиеся через несколько дней после введения, мониторили, а размер опухоли измеряли периодически. На этих графиках каждая кривая представляет кинетику роста опухоли у одной лягушки. Результаты показывают, что у животных, которым вводили 0.5 или 1 µg GP 96, появление опухоли было значительно задержано по сравнению с контрольными группами. Таким образом, GP 96 способствует кросс-презентации опухолевых антигенов у Xenopus.

Таким образом, мы продемонстрировали способ изучения способности GP 96 представлять как минорные, так и опухолевые антигены у лягушек Xenopus laevis с помощью пересадки кожи и тестов по трансплантации опухоли. При выполнении этой процедуры важно помнить, что не следует собирать перитонеальный лаваж, если был поврежден кровеносный сосуд, так как большая часть клеток в таком случае будет представлена эритроцитами, а не макрофагами. Также важно избегать сжатия ткани пинцетом при манипуляциях с кожным трансплантатом, чтобы предотвратить повреждение.

На этом всё. Спасибо за промывку и удачи в ваших экспериментах.