Визуализация и количественной оценки внутриклеточного Взаимодействия Neisseria meningitidis И правам α-актинина по конфокальной микроскопии

Общая цель следующего эксперимента заключается в оценке уровня колокализации интернализованных бактерий RIA Meningitidis с цитоскелетным белком Alpha Actinin. Для этого культивируемые микрососудистые клетки головного мозга человека инфицируют ночной культурой бактерий на период от трех до восьми часов, чтобы бактерии могли проникнуть в клетки-мишени. На втором этапе клетки с внутриклеточными бактериями промывают, фиксируют, а затем пермеабилизируют, подготавливая инфицированную культуру к иммуноокрашиванию интернализованных бактерий и внутриклеточного alpha actinin.

После проведения конфокальной микроскопии и использования программного обеспечения для анализа колокализации можно визуализировать изображения внутриклеточной колокализации и получить количественные результаты, которые показывают, что Meninga Croci, экспрессирующая OPC, а также мембранный белок могут специфически взаимодействовать с внутриклеточным альфа-актинином, что подтверждается данными конфокальной микроскопии и количественным анализом колокализации. Здравствуйте, меня зовут Изель Мария, я представляю лабораторию профессора Мата ТИ на кафедре клеточной и молекулярной медицины Университета Бри. Сегодня мы продемонстрируем вам процедуру оценки уровня колокализации и соотношения внутриклеточных бактерий с белками цитоскелета.

В нашей лаборатории мы используем данную процедуру для изучения взаимодействия мицелия meningitis, экспрессирующего аутомембранный белок OPC, с цитоскелетным белком alpha actin. Итак, приступим. Данная работа должна проводиться в лаборатории с соответствующим уровнем биобезопасности.

За два дня до проведения процедуры иммуноокрашивания инокулируйте исследуемый бактериальный штамм на среду Brain Heart Infusion. Чашки с агаром, дополненным 10% нагретой конской кровью, инкубируют в течение ночи при 37 °C в атмосфере 5% CO2 накануне иммуноокрашивания. Используя культуральную петлю объемом 10 µL, приготовьте суспензию из ночной бактериальной культуры.

В двух миллилитрах PBSB оставьте суспензию на пять минут при комнатной температуре, чтобы крупные бактериальные агрегаты осели. Затем перенесите верхний один миллилитр суспензии в стерильную пробирку, не затрагивая осадок. Растворите бактерии, добавив один миллилитр 1% SDS и 0,1 молярного гидроксида натрия в две пробирки, содержащие по 20 микронлитра бактериальной суспензии, и переверните пробирку для перемешивания. Для оценки количества бактерий.

Измерьте содержание нуклеиновых кислот, определив оптическую плотность раствора. При 216 нм доведите бактериальную суспензию в инфекционной среде до необходимой плотности для заражения микрососудистых эндотелиальных клеток головного мозга человека. Для иммуноокрашивания за два дня до начала эксперимента поместите стеклянные покровные стекла диаметром 16 мм в лунки 12-луночного планшета и высейте клетки H-B-M-E-C-A на покровные стекла до достижения 50% конфлюэнтности. Инкубируйте в течение ночи при 37 °C в атмосфере с 5% CO2, затем переходите к следующим действиям на следующий день.

Заразите клетки свежеприготовленной бактериальной суспензией в условиях нашей лаборатории. Обычно используется соотношение заражения от 200 до 300 колониеобразующих единиц на одну клетку-мишень. Инкубируйте от трех до восьми часов при 37 °C в атмосфере 5% CO2 до конца периода заражения.

Трижды промойте клетки раствором PBS и зафиксируйте их, добавив 500 µL 2% параформальдегида, на 30–45 минут при комнатной температуре. После удаления параформальдегида проведите пермеабилизацию зафиксированных клеток путем инкубации в 0,1% растворе Triton X 100, разведенном в PBS, в течение 10 минут. В завершение трижды промойте образцы раствором PBS и перейдите к иммуноокрашиванию согласно описанному методу. Далее можно одновременно провести окрашивание внутриклеточных бактерий и α-актинина.

В 12-луночных планшетах заблокируйте покровные стекла с пермеабилизированными клетками, добавив 500 µL 3% B-S-A-P-B-S-T на 30–60 минут. После промывки PBS при комнатной температуре перенесите каждое покровное стекло в новую сухую лунку 12-луночного планшета; одновременно добавьте первичные антитела против бактерий и альфа-актинина (достаточно 80–100 µL антител на одно покровное стекло при условии осторожного нанесения для полного покрытия поверхности стекла), инкубируйте в течение одного часа при комнатной температуре. По окончании инкубации добавьте в лунку 200 µL PBS, поднимите покровное стекло и перенесите его в новую лунку, содержащую 500 µL PBS. Через пять минут удалите PBS с помощью пипетки, затем добавьте свежий PBS. Повторите процедуру дважды и перенесите покровные стекла в новую сухую лунку.

Затем добавьте соответствующие вторичные антитела, конъюгированные с разными флуорохромами и разведенные в 1% B-S-A-P-B-S-T. Инкубируйте в течение одного часа при комнатной температуре в темноте; по окончании инкубации проведите промывку, как показано ранее. Затем проведите контрастирование ДНК с помощью DPI в течение пяти минут при комнатной температуре в темноте. После завершения этой инкубации промойте покровные стекла в PBS один раз, а затем зафиксируйте их каплей среды для заключения. Закрепленные покровные стекла следует хранить в темноте до момента наблюдения. Под микроскопом мы исследуем и получаем изображения наших иммуномаркированных образцов, используя конфокальный лазерный сканирующий микроскоп, совмещенный с инвертированным эпифлуоресцентным микроскопом.

Чтобы начать процедуру CLSM, нанесите каплю иммерсионной жидкости на объектив, поместите предметное стекло с покровным стеклом на предметный столик микроскопа, переведите микроскоп в режим визуального наблюдения и с помощью окуляров найдите интересующую область; теперь можно приступить к работе с программным обеспечением Leica. Выберите режим сбора данных XY z. Для исследований колокализации выберите формат 512 на 512.

Чем выше разрешение, тем точнее изображение. Затем выберите двунаправленный режим X, который увеличит скорость сканирования и поможет уменьшить фотовыцветание. Настройте параметры последовательного сканирования.

Нажмите на функцию SEC, а затем выберите соответствующие линии. Выберите лазерные лучи в соответствии с флуорохромами, конъюгированными со вторичными антителами: 405 нанометров для DPI, 488 нанометров для Alexa Fluor 488 и 561 нанометров.

Для Trixy активируйте фотоэлектронные умножители один, два и три соответственно. Установите верхнюю и нижнюю границы Z-стека или серии. Затем установите размер шага по оси Z на 0.2 micrometers.

RIA Mencius представляет собой diplo occus, и поскольку каждый caucus имеет примерный диаметр 0,5 micrometers, размер шага по оси Z, равный 0,2 micrometers, повышает вероятность сканирования каждого caucus как минимум дважды. Установите окончательные параметры сканирования, выбрав усреднение трех линий для улучшения соотношения сигнал/шум, и нажмите кнопку start. Изображения с двойным или тройным окрашиванием получают путем последовательного сканирования на разных длинах волн, используя режим between lines для каждого канала, чтобы исключить перекрестные помехи между различными хромофорами.

Для определения колокализации двух флуорохромов выберите функцию наложения (overlay), чтобы объединить выбранные каналы в одно изображение. Например, при колокализации Alexa 4 88 и trissy Fluor Chromes на наложенном изображении появится желтый цвет. Для 2D-реконструкции, необходимой для визуализации возможной колокализации, сформируйте Z-стек или серию, используя функцию максимальной проекции. После получения Z-стека или серии обработайте данные для получения ортогонального изображения с целью визуализации внутриклеточной локализации различных элементов.

Количественный анализ колокализации выполняется с помощью программного обеспечения Vol City, предоставленного IMP. Для начала создайте библиотеку с изображениями CLSM, затем выберите функцию расширенного фокуса (extended focus) для изображения в верхней панели. Этот инструмент объединит Z-стеки в одно 2D-изображение для последующего анализа.

Теперь выберите инструмент COLOCALIZATION. Два анализируемых канала должны иметь одинаковую разрядность цвета. Выделите область, которую необходимо подвергнуть количественному анализу.

Установите порог для удаления фонового шума. Создайте результат колокализации, выбрав функцию «generate colocalization». Статистика колокализации будет рассчитана для ранее выбранных областей интереса.

Затем выберите коэффициенты Мандера R и ny. Наконец, экспортируйте статистические значения в документ Excel для представления данных; здесь показаны репрезентативные результаты конфокальной визуализации эндотелиальных клеток головного мозга человека, инфицированных meninga cockeye в течение восьми часов. Локализация бактерий показана красным цветом.

В то время как локализация alpha actinin показана зеленым цветом, стрелки указывают на области, в которых, по всей видимости, произошло значительное накопление alpha actinin вокруг бактерий. На этом совмещенном изображении видны несколько областей желто-оранжевого цвета, что свидетельствует о колокализации meninga occi и alpha actinin. На следующем изображении оптическое препарирование инфицированного монослоя H-B-M-E-C указывает на колокализацию вокруг внутриклеточных бактерий, расположенных у основания клетки.

При обработке трехмерных изображений инфицированных монослоев H-B-M-E-C на виде под углом к апикальной поверхности красной стрелкой indicated бактерии Durant, окрашенные в красный цвет, в то время как несколько бактерий расположены ближе к базальным поверхностям эндотелиальных клеток, что указано желтой стрелкой. Отчетливо выраженная оранжево-желтая локализация в базальной области более четко видна на данном XZ-срезе endon. В отличие от этого, эксперименты с актинином, в которых проводилось мечение интернализованных бактерий и либо menton, либо актина, выявляют эпизодическую колокализацию с актином, но редкую колокализацию с fermenting в клетках H-B-M-E-C.

Как было отмечено в предыдущих экспериментах, Retin концентрировался вокруг нескольких интернализованных бактерий, указанных белыми стрелками. Данные также были проанализированы для определения относительного перекрытия. Коэффициент R, который согласно Manda представляет собой истинную степень колокализации IE (количество совместно локализованных пикселей по сравнению с общим количеством пикселей) и значения NY для альфа-актинина, ментинга и актина в целом в клетках H-B-M-E-C, зараженных экспрессирующими OPC менингококками, показали перекрытие Retin в менингококках более 25%.

Коэффициент Y представляет собой меру частоты появления более распространенного сигнала реин каждый раз, когда возникает менее распространенный сигнал менинга кокоа. Данный показатель демонстрирует поразительную степень локализации alpha actinin в непосредственной близости от интернализованного менинга кок-ай. Мы продемонстрируем вам способы визуализации и количественной оценки взаимодействия интернализованных бактерий с элементами цитоскелета в рамках данного эксперимента.

Важно помнить о необходимости строгого соблюдения протоколов фиксации и иммуноокрашивания для сохранения целостности структур и предотвращения высокого уровня фонового сигнала. На этом всё. Спасибо за просмотр и успехов в ваших экспериментах.