Живая клеточного ответа на механическое раздражение Учился по комплексному Оптические и атомно-силовой микроскопии
4 октября 2010 г.
Целью данного документа является указание читателя в работе интегрированной атомно-силовой микроскоп-оптических изображений для механической стимуляции живых клеток в культуре. Шаг за шагом протокол представлен. Набор репрезентативных данных показывает жить клеточного ответа на механическое раздражение представлена.
Изучение клеточного ответа на механическую стимуляцию в режиме реального времени осуществляется путем предварительного выращивания клеток, экспрессирующих слитые белки с GFP, в чашках с стеклянным дном в течение 24 часов. На втором этапе кончик зонда A FM покрывают биотинилированным фибронектином. Затем функционализированный кончик зонда A FM приводят в контакт с поверхностью клетки для формирования прочной фокальной адгезии вокруг кончика A FM, что позволяет осуществлять прямое воздействие на актиновый цитоскелет через связь матринтегрин-актин между покрытым фибронектином кончиком и клеткой.
Заключительным этапом является механическое стимулирование живой клетки путем контролируемого перемещения кончика А FM вверх, чтобы вертикальная сила прикладывалась в точке контакта с клеткой без разрыва прочной фокальной адгезии. В конечном итоге результаты показывают, что клетки реагируют на механическую стимуляцию усилением своего прикрепления к субстрату и индуцированием реорганизации актинового цитоскелета, что было зафиксировано с помощью флуоресцентной оптической визуализации в режиме реального времени. Здравствуйте, я Андреа Трэк, доцент кафедры системной биологии и трансляционной медицины в Texas A&M Health Science Center.
Здравствуйте, я Сум Лим, постдок кафедры системной биологии и трансляционной медицины в Медицинском центре Texas A&M. Сегодня мы продемонстрируем процедуру изучения адаптивного клеточного ремоделирования в ответ на механическую стимуляцию.
В нашей лаборатории мы используем данную процедуру для исследования перестройки цитоскелета в режиме реального времени в живых гладкомышечных клетках сосудов. Итак, приступим. Для этих исследований используется инвертированный микроскоп Olympus IX 81 с модулем флуоресценции с полным внутренним отражением (TIRF) в сочетании со сканирующей головкой CSU 22 Yokogawa.
Атомно-силовой микроскоп Bio Scope SZ установлен поверх инвертированного оптического микроскопа. Вся система размещена на оптическом столе исследовательского класса и была подробно описана ранее. В этом интегрированном микроскопе используются две камеры с электронно-умножающей ПЗС-матрицей (EMCCD) от Quant EM.
Один предназначен для визуализации газона, а другой — для конфокальной микроскопии. Конфокальный узел, состоящий из сканера с вращающимся диском, внешнего колеса фильтров и EMCCD-камеры, установлен на алюминиевой опорной пластине, расположенной на силиконовой подложке, необходимой для гашения вибраций. Весь конфокальный узел соединяется с микроскопом через фланец с резьбовым зажимом.
Таким образом, узел может быть отделен от микроскопа во время атомно-силовой микроскопии или измерений FM, чтобы избежать вибраций от сканирующего диска. Аргон-криптоновый лазер используется в качестве источника возбуждения для обоих режимов визуализации: turf и конфокального. Лазер может быть подключен к любому из двух оптоволокон, которые подают лазерный луч на насадку turf или на конфокальную сканирующую головку.
Системой управляют два компьютера. Один использует программное обеспечение Slide Book для управления оптической визуализацией, а другой — программное обеспечение nano scope для управления AFM. За 24 часа до эксперимента по механической стимуляции поместите живые клетки, экспрессирующие GFP-конструкции, нацеленные на специфические белки, в чашку для культивирования клеток с стеклянным дном. В день эксперимента замените среду для культивирования клеток на среду без фенолового красного.
Поскольку эксперимент с использованием AFM очень чувствителен к шумам, во время проведения исследования избегайте разговоров и не касайтесь оптического стола или микроскопа, чтобы свести шум к минимуму. При проведении измерений AFM отсоедините спиннинговый конфикальный диск от микроскопа. Эксперимент начинается с установки чашки с клеточной культурой на предметный столик AFM с помощью магнитного кольца для фиксации чашки на магнитном столике микроскопа.
V-образный кантилевер зонда АСМ модифицирован биотинилированной стеклянной бусиной размером два микрона. Кантилевер легко виден под микроскопом. Бусина приклеена к самому краю кантилевера — именно сюда следует по каплям наносить раствор для покрытия.
Для подготовки FM-зонда к эксперименту сначала установите иглу в стеклянный держатель, а затем поместите держатель на настольную установку для покрытия иглы. Промойте иглу, осторожно нанося 10 µL фосфатно-солевого буферного раствора без кальция и магния (DPBS) на самый кончик иглы, после чего просушите её с помощью салфетки Kimwipe. Повторите эту процедуру пять раз после промывки раствором DPBS с концентрацией 1 mg/mL.
Раствор Avid. Добавить по каплям на кончик. После нанесения покрытия Avid оставить кончик для инкубации на пять минут.
Промойте наконечник еще пять раз с помощью DPBS. Затем проведите кросс-линкинг биотинилированного фибронектина на avadon, добавляя раствор с концентрацией 1 mg/mL по каплям на наконечник и инкубируя в течение пяти минут.
Наконец, снова промойте кончик пять раз в DPBS, оставив последнюю каплю на кончике. После подготовки установите кончик в АСМ-сканер. После установки АСМ-кончика поместите вокруг держателя защитную силиконовую юбку.
Затем настройте микроскоп для видеонаблюдения. Далее отцентрируйте зонд FM в поле зрения. Настройте оптический рычаг, направив лазерный луч на самый край кантилевера.
Затем замените объектив на подходящий объектив с большим увеличением для визуализации отдельных клеток. После этого переместите в поле зрения клетку, которая будет подвергнута механической стимуляции, и выберите место на поверхности клетки, куда должен опуститься зонд АFM. В завершение опустите зонд АFM до тех пор, пока он не коснется поверхности выбранной клетки.
После того как наконечник коснется клетки, подождите примерно 20 минут. Это необходимо для формирования прочного фокального контакта в точке соприкосновения с поверхностью клетки. По истечении этого времени можно приступать к процедуре механической стимуляции для подготовки к эксперименту по механической стимуляции.
Переключитесь с видеокамеры на EMCCD-камеру, чтобы обеспечить визуализацию флуоресцирующих клеток для получения изображений. Затем получите исходное изображение клетки в состоянии покоя. Для визуализации актинового цитоскелета во всем теле клетки используйте конфокальную микроскопию с вращающимся диском.
Напротив, используйте зонд для визуализации фокальных адгезий при стимуляции клетки. Используйте кантилевер для приложения контролируемого движения вверх с дискретным шагом каждые три-пять минут. При сборе данных А FM оператору важно постоянно контролировать напряжение Z-пьезопозиционера, чтобы определить подходящее время для перемещения вертикального стержня.
Одновременно с регистрацией данных АСМ с помощью программного обеспечения slide book после каждого вертикального растяжения записывайте конфокальное или turf-изображение клетки. По завершении эксперимента по стимуляции извлеките зонд АСМ из клетки. Клетка гладкой мускулатуры сосудов, трансфицированная actin MRFP и vcul.
Визуализацию GFP проводили с помощью FM на апикальной поверхности клетки. Ту же клетку визуализировали с помощью turf на базальной поверхности клетки. Здесь представлены два совмещенных изображения.
Изображение той же клетки также было получено с помощью конфокальной микроскопии с вращающимся диском по всему телу клетки и представлено в виде максимальной проекции 3D-стека. Показано хорошее совпадение изображений, полученных методом A FM и конфокальной микроскопией с вращающимся диском. Клетка гладких мышц сосудов, трансфицированная actin MRFP, подвергалась механической стимуляции с помощью A FM и визуализации методом конфокальной микроскопии с вращающимся диском.
Эти данные указывают на то, что актиновые филаменты подвергаются значительной перестройке при стимуляции с помощью FM. В результате механического воздействия одни актиновые филаменты полимеризуются, другие — деполимеризуются, а некоторые объединяются в пучки. Учитывая перестройку актина, мы продемонстрировали способ механической стимуляции живой клеточной культуры с использованием EFM с одновременной регистрацией перестройки цитоскелета методами оптической визуализации.
При выполнении данной процедуры важно помнить, что эксперимент с ФМ крайне шумный и чувствительный. На этом все. Спасибо за просмотр и удачи в ваших исследованиях.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании представлен протокол использования интегрированного атомно-силового и оптического микроскопа для механической стимуляции живых клеток в культуре. Методика включает пошаговое руководство и демонстрирует репрезентативные данные о реакциях живых клеток на механическую стимуляцию.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Биология клетки
- Механическая стимуляция
- Визуализация живых клеток
Теоретические сведения
- Понимание реакции клеток на механические стимулы имеет решающее значение в клеточной биологии.
- Атомно-силовая микроскопия позволяет осуществлять точные манипуляции с клетками.
- Визуализация живых клеток обеспечивает получение данных о клеточных процессах в режиме реального времени.
- Фокальная адгезия играет ключевую роль в прикреплении клеток и их ответе на стимулы.
Цель исследования
- Обучить работе со специализированным микроскопом для исследования живых клеток.
- Продемонстрировать эффекты механической стимуляции живых клеток.
- Предоставить подробный протокол для воспроизведения исследования другими учеными.
Используемые методы
- Клетки, экспрессирующие слитые белки с GFP, культивируют в стеклянных чашках.
- Зонд АСМ покрывают биотинилированным фибронектином.
- Функционализированный зонд АСМ используют для создания фокальных контактов с поверхностью клетки.
- Механическая стимуляция осуществляется путем контролируемого перемещения зонда АСМ вверх.
Основные результаты
- После стимуляции клетки усилили свою прикрепляемость к субстрату.
- В ответ на механическое воздействие наблюдалась реорганизация актинового цитоскелета.
- Динамика клеточных ответов была зафиксирована с помощью флуоресцентной визуализации в реальном времени.
- Протокол успешно продемонстрировал эффективность данной методики.
Выводы
- Интегрированный микроскоп позволяет эффективно изучать реакции живых клеток на механические стимулы.
- Данный метод может углубить понимание клеточной механики и адгезии.
- Перспективы применения метода включают исследование различных типов клеток и условий.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Понимание того, как живые клетки воспринимают механические воздействия и адаптируются к ним, имеет решающее значение для снижения рисков при валидации мишеней в путях механотрансдукции. Данный комплексный подход, сочетающий АСМ и оптическую визуализацию, позволяет в режиме реального времени с субклеточным разрешением изучать динамику цитоскелета и адгезии, обеспечивая прогностическую уверенность на ранних этапах поиска за счет установления связи между механическими стимулами и структурной реорганизацией. Метод способствует механистическому снижению рисков путем прямой визуализации индуцированного силой ремоделирования актина и укрепления фокальных адгезий, что позволяет принимать обоснованные решения о целесообразности дальнейшей разработки (go/no-go) при выборе мишеней на доклиническом этапе.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишеней
- Научная ценность: Позволяет проверить терапевтические гипотезы, выявляя механизмы того, как механическая стимуляция вызывает реорганизацию актинового цитоскелета и укрепление фокальных адгезий.
- Практическая ценность: Обеспечивает функциональную валидацию мишеней посредством прямого наблюдения за зависимой от силы динамикой цитоскелета в живых адгезивных клетках.
- Прогностическая ценность: Облегчает приоритизацию портфеля исследований путем установления связи между механическими воздействиями и структурными изменениями, что снижает неопределенность при взаимодействии с механочувствительными мишенями.
Скрининг и разработка методов анализа
- Научная ценность: Подготовка валидированных биологических систем для последующих этапов анализа путем создания воспроизводимых протоколов механической стимуляции и визуализации в режиме реального времени.
- Практическая ценность: Обеспечение стандартизации анализа и получение количественных данных за счет контролируемого перемещения зонда АСМ и синхронизированного считывания флуоресценции.
- Масштабируемость: Возможность повторного использования платформы для различных типов адгезивных клеток, что позволяет проводить надежную оценку соединений в рамках скрининговых кампаний в области механобиологии.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная преемственность: Обсуждается значимость для изучения заболеваний путем демонстрации структурного сопряжения от апикальной поверхности к базальной, при котором апикальная стимуляция вызывает реорганизацию во всем теле клетки.
- Разработка с учетом рисков: Описывается преемственность от этапа открытия до доклинической валидации путем фиксации динамических ответов, которые позволяют согласовать биомаркеры в путях механотрансдукции.
- Механистическое снижение рисков: Основное внимание уделяется прогностической ценности снижения рисков путем демонстрации того, как приложение силы приводит к полимеризации, деполимеризации и пучкованию актина, что проясняет механизм действия.
Интеграция в конвейер и рабочий процесс
Данный метод интегрируется в непрерывный процесс поиска — от проверки гипотез до идентификации перспективных соединений, обеспечивая понимание механизмов действия до начала скрининга соединений.
- Биологические открытия: Разъясняется, каким образом данный метод способствует проверке гипотез путем применения контролируемой механической стимуляции и наблюдения за перестройкой цитоскелета в режиме реального времени.
- Скрининг: Описывается готовность анализа к применению благодаря воспроизводимому формированию фокальных адгезий и количественной визуализации динамики актина с использованием TIRF-микроскопии и конфокальных методов.
- Аналитика: Особое внимание уделяется таким измерениям, как события полимеризации/деполимеризации актина и изменения интенсивности фокальных адгезий, которые позволяют сравнивать стимулированные и покоящиеся состояния.
- Трансляционные исследования: Метод связывается с преклинической преемственностью, демонстрируя, как апикальная механическая стимуляция распространяет структурные изменения через тело клетки, что имеет значение для передачи усилий на уровне ткани.
- Практическое применение: Метод представлен как универсальный инструмент для изучения механочувствительных мишеней в моделях сосудистых, эпителиальных и мезенхимальных клеток.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышение прогностической достоверности при валидации мишеней, снижение механистической неоднозначности в путях механотрансдукции.
- Операционная ценность: Стандартизация, воспроизводимость и масштабируемость механической стимуляции и мультимодальной визуализации.
- Стратегическая ценность: Более обоснованные решения о продолжении или прекращении разработки (go/no-go), эффективность использования капитала и снижение биологических рисков на поздних стадиях в программах по механобиологии.
- Влияние на портфель: Приоритизация и принятие решений о продвижении проектов с учетом рисков на основе прямого наблюдения за клеточной адаптацией, индуцированной силой.
Особенности реализации
- Требуется научная компетенция в области работы с АСМ, визуализации живых клеток и динамики цитоскелета.
- Необходимое оборудование включает интегрированную систему АСМ-TIRF-конфокальной микроскопии с виброизоляцией и двумя EM-CCD камерами.
- Стандартизация между исследовательскими группами требует строгого соблюдения протоколов функционализации зонда, формирования фокальных адгезий и времени стимуляции.
- При адаптации метода следует учитывать различия в жесткости субстрата, белках покрытия и типах клеток, сохраняя при этом специфичность апикальной стимуляции.
- Практические ограничения включают чувствительность к шумам при измерениях АСМ и необходимость контроля условий окружающей среды для минимизации дрейфа.
