Ориентация глубинных структур мозга с Микроинъекции для доставки лекарственных средств, вирусные векторы, или клеточных трансплантатов
1 декабря 2010 г.
В этой статье мы покажем способ сделать стеклянный капилляр иглы с 50-мкм просвет. Этот метод значительно сокращает повреждение головного мозга, снижает пассивной диффузии лекарственных препаратов и позволяет точного прицеливания в грызун мозга.
Общая цель данной процедуры заключается в выполнении высокоточных микроинъекций в глубокие структуры головного мозга для доставки лекарственных препаратов, вирусных векторов или трансплантатов клеток. Это достигается путем предварительного изготовления стеклянных капиллярных игл с просветом 50 µm. Вторым этапом процедуры является заполнение 50% объема иглы минеральным маслом с помощью капиллярного эффекта и введение поршня с широкого конца трубки.
Третьим этапом процедуры является заполнение иглы веществом или суспензией клеток, которую необходимо ввести. Заключительным этапом является введение кончика иглы и инъекция вещества с очень низкой скоростью потока в глубокие структуры головного мозга. В итоге можно получить результаты, демонстрирующие высокоточное адресное введение веществ в мозг с помощью микроинъекций через стеклянную капиллярную трубку.
Здравствуйте, меня зовут Оскар Гонсалес, я представляю Лабораторию нейробиологии факультета психологии Университета Колима, Мексика. Сегодня мы продемонстрируем процедуру микроинъекции с использованием стеклянной капиллярной трубки для введения препаратов в мозг мыши. Мы применяем этот метод в нашей лаборатории для изучения нейральных стволовых клеток взрослых особей.
Итак, приступим. Использование стеклянных капиллярных игл с просветом 50 µm для микроинъекций в мозг значительно снижает повреждение тканей мозга, минимизирует пассивную диффузию препаратов и обеспечивает точное воздействие на целевые области мозга грызуна. Перед проведением микроинъекций необходимо изготовить стеклянные иглы.
Начните с установки капиллярной стеклянной трубки в вытягивающий электрод с высоким сопротивлением микропипеточного пуллера. Затем включите электрод микропипеточного пуллера. Чтобы нагреть середину стеклянной трубки для её локального размягчения, растяните трубку вдоль её продольной оси на начальное расстояние от трех до пяти миллиметров, достаточное для уменьшения диаметра стеклянной трубки в локализованной области.
Продолжайте растягивать стеклянную трубку до тех пор, пока она не разорвется. Повторите эти действия, чтобы изготовить две идентичные одноканальные иглы. Теперь поместите стеклянные иглы в микрокузницу.
Угла в 30 градусов достаточно для скоса кончика. В завершение поместите иглы под микроскоп и убедитесь, что обе имеют правильный внутренний диаметр. Для большинства гидрофильных препаратов при данной конструкции игл идеальным является внутренний диаметр от 30 до 50 µm.
Рассмотрим, как использовать их для микроинъекций. Для начала заполните изготовленную иглу минеральным маслом с самого широкого конца. Дождитесь, пока минеральное масло затечет по капилляру примерно на 50% длины капиллярной трубки.
Нанесите вакуумную смазку высокого давления на самый широкий конец иглы и вставьте через него поршень. Осторожно вытесняйте минеральное масло до тех пор, пока из кончика стеклянной иглы не выступит маленькая капля. Теперь закрепите иглу в держателе микроинъектора и приступайте к подготовке животного к инъекции.
Сначала поместите грелку на стереотаксический держатель для животных, чтобы поддерживать температуру тела животного. При температуре 37 °C выбрейте шерсть на голове обезболенной мыши, затем поместите её в стереотаксический прибор и зафиксируйте. Используя ушные фиксаторы и зубной держатель, с помощью хирургического скальпеля сделайте разрез кожи от ушей до линии лямбда (Lambda) черепа.
Протрите череп ватным тампоном, чтобы удалить влагу, и отведите кожу из операционного поля. Затем с помощью кончика стеклянной иглы отметьте вершину шва bgma и установите там исходную точку инъекции. Теперь, перемещая оси X и Y стереотаксического устройства над черепом, определите точку на черепе, в которой будет выполнено сверление.
С помощью лабораторного микроперфоратора осторожно просверлите отверстия в выбранных координатах, используя тонкий пинцет. Осторожно удалите самый глубокий слой кости и проколите твердую мозговую оболочку. Вы заметите вытекание спинномозговой жидкости.
Чтобы убедиться, что игла проходит через просверленные отверстия, медленно опустите стеклянную иглу, используя ось Z стереотаксического прибора. Затем наберите в пипетку 1 µL препарата для инъекции и нанесите его на небольшой кусочек парафина. Поместите парафин на череп.
Наберите препарат, вращая колесо микроинъектора, и при этом контролируйте под микроскопом подъем жидкости в стеклянную иглу. Удалите парафильм и сбросьте нулевую координату. Теперь переместите иглу в выбранные координаты и опустите держатель до тех пор, пока кончик стеклянной иглы осторожно не коснется поверхности мозга, после чего установите Z.Coordinate на ноль.
Введите стеклянную иглу в паренхиму головного мозга на необходимую глубину. Медленно введите препарат со скоростью примерно один нанолитр в секунду. После введения требуемого объема дайте препарату диффундировать в паренхиму в течение двух минут, затем плавно и медленно извлеките иглу.
В завершение склейте края хирургического разреза и снимите животное со стереотаксического аппарата. Поместите животное в клетку с подогревом для восстановления после анестезии. Теперь мы продемонстрируем результаты микроинъекций.
Лизофосфатидилхолин или lyin вводили в мозолистое тело для индуцирования демиелинизации трактов белого вещества, при этом объем вводимого lyin составлял всего 20 л, чтобы минимизировать повреждение мозга стеклянной иглой. Демиелинизация характеризуется отсутствием экспрессии основного белка миелина в трактах белого вещества; благодаря очень точному введению и использованию очень тонкой иглы повреждение тканей мозга сводится к минимуму.
Мы только что продемонстрировали вам способ изготовления стеклянных игл для выполнения микроинъекций в глубокие структуры головного мозга. При проведении этой процедуры важно помнить о необходимости подготовить всё оборудование и материалы для использования в операционной. На этом всё.
Благодарим за просмотр и желаем успехов в ваших экспериментах.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлен метод изготовления стеклянных капиллярных игл с внутренним диаметром 50-µm, что позволяет выполнять точные микроинъекции в глубокие структуры головного мозга. Данная методика сводит к минимуму повреждение тканей мозга и снижает пассивную диффузию препаратов, обеспечивая таргетную доставку веществ в моделях грызунов.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Методы микроинъекций
- Системы доставки лекарственных средств
Теоретическая база
- Микроинъекции необходимы для доставки веществ непосредственно в мозг.
- Традиционные методы могут вызвать значительные повреждения мозга и неэффективную доставку лекарственных средств.
- Стеклянные капиллярные иглы позволяют обеспечить точность наведения.
- Данное исследование сосредоточено на совершенствовании процесса микроинъекций.
Цель исследования
- Разработать метод изготовления стеклянных капиллярных игл с внутренним диаметром 50-µm.
- Повысить точность доставки лекарственных средств в глубокие структуры головного мозга.
- Минимизировать повреждение тканей мозга в процессе инъекции.
Используемые методы
- Изготовление стеклянных капиллярных игл с внутренним диаметром 50 µm.
- Заполнение иглы минеральным маслом для облегчения инъекции.
- Загрузка в иглу необходимого вещества или клеточной суспензии.
- Инъекция вещества с низкой скоростью потока в целевые области мозга.
Основные результаты
- Метод позволяет осуществлять точное введение веществ в мозг.
- Значительное снижение повреждения тканей мозга по сравнению с традиционными методами.
- Эффективная доставка лекарственных препаратов, вирусных векторов или трансплантатов клеток.
- Продемонстрированная эффективность на моделях грызунов.
Выводы
- Разработанный метод повышает точность микроинъекций.
- Он обеспечивает надежный способ доставки лекарственных препаратов в нейробиологических исследованиях.
- Данный подход может быть применен к различным веществам, что позволяет улучшить результаты экспериментов.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Точная доставка терапевтических агентов в глубокие структуры мозга остается критической проблемой при разработке нейробиологических препаратов, особенно на моделях мелких животных, где процедура травматизации может исказить результаты. Данный метод микроинъекций повышает точность воздействия на цель за счет минимизации повреждения тканей, вызванного инъекцией, и пассивной диффузии, что повышает достоверность исследований фармакологического и генетического вмешательства. Этот подход способствует снижению рисков при изучении механизмов на ранних этапах поиска, обеспечивая воспроизводимую доставку малых объемов лекарственных средств, вирусных векторов или клеточных трансплантатов с уменьшением биологической вариабельности.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет точно проверить терапевтические гипотезы в глубоких ядрах мозга за счет снижения побочных эффектов, вызванных травмой при инъекции.
- Практическая ценность: обеспечивает стабильное введение соединений или генетических инструментов в различных исследованиях, повышая воспроизводимость рабочих процессов по валидации мишеней.
- Прогностическая достоверность: минимизирует процедурную вариабельность, которая могла бы скрыть истинные фармакологические или биологические ответы.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Подготовка валидированных биологических систем с минимальным повреждением тканей для последующего скрининга соединений в путях ЦНС.
- Практическая ценность: Обеспечение стандартизированных инъекций малых объемов (20–100 nl), подходящих для форматов высокоточного анализа, требующих строгого фармакокинетического контроля.
- Повторное использование платформы: Возможность адаптации для различных веществ (лекарственных препаратов, вирусных векторов, клеток) путем изменения диаметра просвета иглы, что поддерживает проведение мультимодальных кампаний по скринингу.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: повышает достоверность модели заболевания за счет снижения влияния побочных повреждений, вызванных процедурами инъекций, что улучшает трансляционную значимость.
- Практическая ценность: облегчает проведение повторяющихся вмешательств в лонгитюдных исследованиях, поддерживая режимы хронического введения препаратов или трансплантации клеток.
- Прогресс с учетом рисков: повышает уверенность в данных о взаимодействии с мишенью, помогая принимать решения о продолжении или прекращении (go/no-go) доклинических программ.
Интеграция конвейера и рабочих процессов
Данный метод вписывается в континуум разработки — от валидации мишени до оптимизации ведущих соединений, где точная доставка в ЦНС имеет решающее значение для оценки модуляции мишени и активации сигнальных путей.
- Открывающая биология: способствует проверке гипотез в глубоких структурах мозга, обеспечивая точное введение фармакологических или генетических зондов.
- Скрининг: обеспечивает количественное, воспроизводимое дозирование для оценки соединений in vivo, что критически важно для исследований зависимости «доза-эффект» и степени насыщения мишени.
- Аналитика: позволяет получать чистые результаты за счет минимизации процедурного шума, улучшая детектирование сигнала при измерении биомаркеров или эффективности.
- Трансляционные исследования: обеспечивает преемственность от этапа открытия до доклинических исследований за счет стабильного, низкотравматичного введения препаратов на всех фазах исследования.
- Корпоративное повторное использование: представляет собой стандартизированный, адаптируемый метод доставки в ЦНС, применимый в различных проектах и модальностях.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает достоверность прогнозов при валидации мишени за счет снижения неопределенности механизмов, вызванной артефактами инъекции.
- Операционная ценность: улучшает воспроизводимость и стандартизацию в различных лабораториях и исследованиях благодаря определенным параметрам подготовки иглы и проведения инъекции.
- Стратегическая ценность: повышает эффективность использования капитала за счет сокращения числа неудачных исследований, вызванных процедурной вариабельностью или нецелевыми эффектами.
- Влияние на портфель: обеспечивает более надежную приоритизацию мишеней ЦНС на основе более чистых фармакологических и генетических данных.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области микрохирургии, стереотаксического координирования и изготовления игл с использованием пипетовытягивателя и микрокузницы.
- Необходимо наличие специализированного оборудования, включая стереотаксическую раму, микроинжектор и микроскоп для визуализации игл.
- Требуется стандартизация размера просвета иглы (50 µm) и протокола заполнения (50% минерального масла) для обеспечения стабильности результатов у разных пользователей.
- Адаптация к различным модельным системам может потребовать корректировки координат и подтверждения глубины проникновения иглы.
- Практические ограничения включают технические навыки, необходимые для вытягивания и формирования скоса иглы, а также низкую пропускную способность, характерную для ручного микроинжектирования.
