Дифференциальная изображений биологических структур с Вдвойне-резонансной когерентного антистоксова рассеяния света (КАРС)

В данном видео демонстрируется процедура дифференциальной визуализации двух рамановских резонансов, связанных с биологическими структурами с когерентными сигналами рамановского рассеяния. Сначала три синхронизированных короткоимпульсных лазера совмещаются во времени и пространстве. Затем совмещенные импульсы направляются в стандартный инвертированный микроскоп, что позволяет генерировать когерентные рамановские сигналы от микроскопических объектов.

Сигналы преобразуются в изображения с помощью коммерческого программного обеспечения для сравнения различных получаемых рамановских сигналов. Результаты показывают, что разница между изображениями, полученными с помощью двухрезонансных и однорезонансных рамановских сигналов, обеспечивает повышенную чувствительность к слабым рамановским сигналам. Здравствуйте, я Тайлер Уикс из Центра биофотоники Калифорнийского университета в Дэвисе.

Я Томас ER из Центра биофотоники и отделения внутренних болезней Калифорнийского университета в Дейвисе. Сегодня мы продемонстрируем процедуру использования двухрезонансного когерентного антистоксова рамановского рассеяния для получения химически специфических изображений клеток. Мы используем эту процедуру для обнаружения сигналов от молекул, которые слишком слабы для прямого детектирования только с помощью когерентной антистоксовой рамановской спектроскопии.

Приступим. Для одновременной генерации сигналов CARS и Dr CARS требуются три перестраиваемых и синхронизированных короткоимпульсных лазерных источника. Чтобы получить такие синхронизированные импульсы, начните с одного короткоимпульсного лазера с выходной мощностью 10 watts, фиксированной длиной волны 1064 nanometers, фиксированной длительностью импульса 7 picoseconds и фиксированной частотой повторения 76 megahertz.

С помощью серии полуволновых пластинок и кубов с поляризационным светоделителем пучок разделяется на три части. Комбинация полуволновой пластинки и куба с поляризационным светоделителем позволяет регулировать мощность каждого компонента пучка, не меняя его направления. Как правило, мощность двух пучков настраивают примерно на 4.5 watts каждый, а третий пучок содержит оставшийся один watt.

Затем два высокомощных луча направляются в два независимых оптических параметрических осциллятора (OPO). В OPO используется процесс генерации частот для преобразования одного высокоэнергетического фотона в два фотона с более низкой энергией и разными длинами волн. Путем контроля температуры кристалла, в котором достигается этот эффект, длину волны результирующих фотонов можно регулировать с точностью до 0,1 нанометра.

Путем удвоения частоты этих сигналов лазер с фиксированной длиной волны 1064 нанометров теперь может быть преобразован в лазерный луч с перестройкой в диапазоне от 780 нанометров до 910 нанометров за счет накачки двух отдельных ОПО одним и тем же источником с длиной волны 1064 нанометров. Таким образом получаются два независимо перестраиваемых лазерных источника, которые автоматически синхронизированы с исходным лазером накачки. Третий луч лазера накачки с длиной волны 1064 нанометров направляется в обход ОПО с помощью системы диэлектрических зеркал, чтобы впоследствии все три луча могли быть объединены.

Для эффективной генерации когерентных фотонов рамановского сигнала рекомбинированные импульсы должны перекрываться как во времени, так и в пространстве, поскольку ОПО содержат кольцевые резонаторы, позволяющие каждому лазерному импульсу проходить через кристалл несколько раз; таким образом, луч, проходящий через ОПО, преодолевает дополнительное расстояние, что приводит к значительной задержке относительно исходного пучка накачки. Это расстояние необходимо компенсировать с помощью третьего луча, установив дополнительные зеркала, которые заставляют этот луч пройти такое же расстояние, как и два других, перед их рекомбинацией с использованием дихроичных зеркал для точной регулировки длины пути. Каждый луч направляется через регулируемые стадии задержки, которые позволяют настроить временное перекрытие различных лазерных импульсов.

К каждому лучу добавляют еще один набор полуволновых пластинок и кубов с поляризационными светоделителями для возможности независиной регулировки мощности каждого лазерного луча. Дихроичные зеркала используются сначала для объединения лучей от двух OPO, а затем для объединения с лучом 1064 нанометров; при этом необходимо принять меры для обеспечения точного пространственного перекрытия лучей. Это можно проверить, сравнив степень перекрытия лучей на расстоянии нескольких сантиметров от дихроичного зеркала и примерно в одном метре от него.

Поскольку воздействие лазерных лучей с высокой средней мощностью может повредить образец, три объединенных луча направляются через электрооптический модулятор, выполняющий функцию селектора импульсов, что позволяет регулировать частоту повторения импульсов, поступающих на образец, и, следовательно, среднюю мощность. Затем объединенные лазерные лучи вводятся в перевернутый микроскоп с объективом с высокой числовой апертурой (NA). Сильная фокусировка, обеспечиваемая объективом с высоким NA, позволяет максимально эффективно генерировать когерентные рамановские сигналы на микроскопических масштабах длины.

Объектив микроскопа установлен на пьезоэлектрическом столике с перемещением по осям X, Y, Z, что позволяет получать изображения путем растрового сканирования образца лучами, аналогично коммерческим конфокальным микроскопам со сканированием луча. Теперь рассмотрим, как генерируются сигналы CARS и DRFWM. Взаимодействие трех короткоимпульсных лазерных лучей в образце приводит к генерации нескольких сигналов четырехволнового смешения, таких как CARS от различных комбинаций двух лазеров, а также трехцветные сигналы CARS и DR-CARS от комбинации всех трех лазеров. Когда длины волн сигналов достаточно близки, их разделение для анализа может быть затруднено.

По этой причине сигналы поступают в спектрометр с функцией визуализации, который также служит монохроматором или полосовым фильтром для пространственного разделения сигналов на разных длинах волн. Электронно-приводное поворотное зеркало внутри спектрометра в опущенном положении направляет сигнал на камеру с ПЗС-матрицей (CCD) с глубоким обеднением и задней засветкой, которая предоставляет спектроскопическую информацию по всему диапазону сигналов и позволяет идентифицировать и оптимизировать различные когерентные сигналы ротона для выбора сигнала, подлежащего визуализации. Для центрирования интересующего пика на ПЗС-камере просто поверните дифракционную решетку внутри спектрометра, используя supplied supplied программное обеспечение для управления и сбора данных от производителя.

Затем измените положение поворотного зеркала, чтобы перенаправить сигнал во второй выходной порт, к которому подключен лавинный фотодетектор (APD) для счета одиночных фотонов или фотодиод (PD). Выполните растровое сканирование объективом, а затем используйте сигналы, зарегистрированные APD, для создания изображения с помощью программного обеспечения для сбора данных, отобразив скорость счета фотонов для каждого пикселя. Повторите эту процедуру визуализации для каждого интересующего когерентного рамановского сигнала, чтобы иметь возможность сравнить сигналы в процессе последующей обработки.

Теперь рассмотрим, как правильно подготовить образец для получения четких и воспроизводимых изображений. При подготовке образцов необходимо соблюдать определенные меры предосторожности. Образцы обычно готовят на стеклянных покровных стеклах толщиной примерно 150 мкм.

Данные покровные стекла достаточно тонкие, чтобы обеспечить получение изображений высокого разрешения с использованием объективов с высокой NA для погружения в воду или масло, которые применяются в этих экспериментах. Чтобы продемонстрировать подготовку типичного образца, мы готовим срезы мышечной ткани мыши толщиной примерно 20 micron, которые фиксируются на предметном стекле микроскопа. К образцу добавляют каплю 20 microliter пятимолярного раствора дейтерированной глюкозы.

Раствор дейтерированной глюкозы создает уникальный и интенсивный фоновый сигнал Рамана. На образец помещают стеклянную покровное стекло и фиксируют его с помощью лака для ногтей, подходящего для клеток и культур. Можно использовать культуральные чашки со стеклянным дном, которые позволяют проводить визуализацию без необходимости отделять клетки от подложки для их выращивания.

Теперь давайте разберем, как определить подходящие рамановские пики для данной установки. Чтобы эффективно использовать эффект двойного резонансного усиления, необходимо знать рамановские спектры обоих резонансных веществ. Как правило, это 2 845 см⁻¹, соответствующих липидам, и 2 121 см⁻¹ для моды растяжения C-D, характерной для дейтерированной глюкозы.

Когерентное рамановское рассеяние достигается, когда разность частот двух лазеров совпадает с частотой молекулярного колебания. При настройке одного OPO на 817 нанометров он будет зондировать моду С с частотой 2 845 обратных сантиметров в сочетании с лазерным лучом 1064 нанометра, а при настройке другого OPO на 868 нанометров он будет зондировать частоту 2 121 обратный сантиметр в сочетании с лучом 1064 нанометра. В спектроскопическом режиме микроскоп CARS позволяет наблюдать три интересующих когерентных рамановских сигнала: сигнал CARS, зондирующий колебания растяжения CH, сигнал CARS, зондирующий моду растяжения CD, и сигнал DR-CARS, зондирующий оба этих режима; на представленной схеме пунктирными стрелками обозначены фотоны лазера в OPO, а сплошными стрелками — результирующий сигнал.

Сплошные горизонтальные линии указывают на энергию рамановской вибрации и наглядно демонстрируют, что в DR-камерах одновременное смешивание одних и тех же трех входных фотонов позволяет зондировать две разные рамановские вибрации. Интенсивность сигнала для каждого пика необходимо будет оптимизировать путем тонкой настройки вокруг положений этих пиков. Здесь мы выбираем каждый пик и снимаем изображения морских червей sea elgan в растворе деградированной глюкозы; извлечение дополнительной информации на основе этих трех полученных по отдельности изображений требует довольно простой обработки изображений.

Сначала необходимо нормализовать изображения. Практический метод нормализации основан на том, что липиды гидрофобны. Это означает, что в областях с высокой плотностью липидов резонанс КД глюкозы должен вносить минимальный вклад в сигнал двойного резонанса.

И наоборот, в областях чистого раствора глюкозы резонансы CH от липидов также должны давать очень малый вклад. С учетом этого нормируйте изображение DR-канала и изображение канала, полученное на резонансе CD раствора дейтерированной глюкозы, по области, находящейся далеко за пределами червя CL egan's, где резонанс CH должен отсутствовать. Затем определите в изображении CH-резонансного канала область внутри червя, богатую липидами, и нормируйте ее по соответствующей области в нормированном изображении DR-канала.

Для корректной работы этого метода следует считать, что глубоко внутри данной области дейтерированная глюкоза отсутствует. Это допущение обосновано тем, что липиды гидрофобны и не смешиваются с раствором. Теперь, вычитая нормализованное изображение CAR на резонансе CH из нормализованного изображения CAR на резонансе DR, можно получить только усиленный сигнал резонанса CD; аналогичным образом, вычитая нормализованное изображение CAR на резонансе CD из нормализованного изображения Dr.FWM, получают соответствующий сигнал.

Здесь показан только усиленный резонансный сигнал CH; представлен спектр КР модифицированной олеиновой кислоты, содержащей алкинильную модификацию. Сильные резонансы CH при 2 845 cm⁻¹ и алкинильный резонанс при 2 121 cm⁻¹ хорошо отделены от области «отпечатков пальцев» (области с плотным скоплением пиков), что делает их идеальными маркерами для когерентной КР-визуализации. Это типичный спектр когерентных КР-сигналов, возникающих при перекрытии трех короткоимпульсных лазеров внутри образца. Стрелки указывают на процессы, ответственные за каждый сигнал, в соответствии с энергетическими диаграммами.

Это типичные результаты визуализации червей C Elgin с использованием DR-CARS и CARS. В верхнем ряду были использованы три только что продемонстрированные сигналы для визуализации червя в растворе глюкозы пониженной концентрации. Во втором ряду изображения были соответствующим образом нормализованы, а в третьем ряду были получены разностные изображения путем вычитания каждого из CARS-изображений из DR-CARS-изображения. Мы только что продемонстрировали вам, как выполнять разностную рамановскую визуализацию на основе микроскопии когерентного антистоксова рассеяния с двойным резонансом.

При выполнении данной процедуры помните, что важно обеспечить надлежащее перекрытие и синхронизацию пучков. Также при переключении между различными когерентными сигналами следите за тем, чтобы не задеть и не сдвинуть образец, так как это повлияет на анализ. На этом всё.

Благодарим за просмотр и желаем успехов в ваших экспериментах.