Многоцветный Покадровый изображений трансгенных данио рерио: Визуализация сетчатки стволовых клеток, активированных нейронов Целевые абляция сотовый

Экспрессия флуоресцентных репортеров у трансгенных животных позволяет отслеживать клеточные реакции на экспериментальные манипуляции в живых моделях заболеваний. В данной работе у zebrafish фармакологически индуцирована селективная гибель клеток; с помощью многоцветной конфокальной микроскопии высокого разрешения получены изображения целевых клеток и их ближайших соседей непосредственно до, сразу после и через определенные интервалы времени после введения препарата. Анализ изображений демонстрирует активацию популяций эндогенных стволовых клеток и последующее замещение целевых клеток в фазе восстановления.

Этот метод поможет ответить на ключевые вопросы в области регенеративной биологии, такие как: каковы клеточные и молекулярные механизмы, используемые для регенерации отдельных типов клеток? Начните с переноса трансгенных икринок, собранных после спаривания, в чашку Петри с 0.3 x danio solution через 16 часов после оплодотворения. Добавьте PTU для ингибирования активности тирозиназы до появления каких-либо признаков пигментации в интересующей ткани. Если эмбрион не является альбиносом, инкубируйте эмбрионы при 28.5 °C.

Как только проявятся репортеры, поместите чашку Петри под флуоресцентный стереомикроскоп с зумом и проведите селекцию по желаемой экспрессии трансгена. Перед визуализацией приготовьте 0,5% раствор для монтажа на основе низкоплавящего агарозы в среде для эмбрионов и выдержите его при температуре 40 °C.

При необходимости добавьте trica и PTU. Осторожно перемешайте и верните в среду при температуре 40 °C. Анестезируйте рыб, поместив их в эмбриональную среду, содержащую trica.

Примерно в течение трех минут рыбы будут находиться в состоянии отсутствия реакции. Чтобы перенести их с помощью микропипетки, заберите отдельную рыбу в обрезанный наконечник пипетки в объеме примерно 30 µL раствора анестетика. Затем переверните пипетку и дайте рыбе опуститься на дно.

Коснитесь кончиком наконечника раствора для монтирования и дайте образцам переместиться под действием силы тяжести. Следите за тем, чтобы не разбавить агар, чтобы его можно было использовать повторно. Удалите остатки раствора анестетика из микропипетки.

Затем, используя тот же наконечник, перенесите рыбку в чашку Петри. В объеме примерно 30 µL фиксирующего раствора аккуратно ориентируйте рыбку так, чтобы исследуемая область находилась в центре капли aeros. Убедитесь, что рыбка сохраняет нужное положение до полного затвердевания aeros.

При желании в одну чашку Петри можно поместить несколько особей рыб. После затвердевания агарозы перенесите рыб на предметный столик конфокального микроскопа и осторожно добавьте в чашку среду для эмбрионов, содержащую trica, с добавлением или без PTU, пока рыбы не будут полностью погружены в жидкость. Откройте программное обеспечение для визуализации и сфокусируйтесь на интересующей области для оптимального получения изображений клеточных и/или молекулярных деталей.

В программном обеспечении используйте объективы с большим рабочим расстоянием и высокой числовой апертурой. Выберите соответствующие флуорофоры из выпадающего списка. Перейдите в настройки спектра и отрегулируйте диапазоны эмиссии.

Для обеспечения четкого разделения сигналов репортеров и максимального отношения сигнал/шум выберите соответствующий объектив в выпадающем меню, чтобы все программные предустановки были настроены правильно. Для фокусировки лазеров и установки уровней мощности выберите из справочной таблицы вариант вывода, при котором наблюдается насыщение пикселей для каждого канала.

Затем установите чувствительность детектора для получения желаемого качества изображения, постепенно увеличивая мощность лазера до достижения приемлемой интенсивности изображения. Избегайте насыщения пикселей в интересующей области и поддерживайте мощность лазера на минимально возможном уровне, чтобы снизить риск фотообесцвечивания и фототоксичности.

Убедитесь, что каждая лазерная линия создает детектируемый сигнал только в соответствующем канале, вручную включая и выключая лазеры при одновременном мониторинге всех каналов визуализации. Если перекрестных помех не обнаружено, данные всех каналов можно собирать одновременно. Затем с помощью функций масштабирования и поворота выберите интересующую область обзора.

Затем установите скорость сканирования и размер изображения; использование более высоких скоростей сканирования позволяет минимизировать время задержки лазера и повысить временное разрешение. Установите размер шага по оси Z в соответствии с требованиями эксперимента. В данном случае используется шаг 10 microns для получения изображений семи оптических срезов ткани сетчатки.

После определения подходящих настроек выполните захват изображений в системе Zack и сохраните их. Затем перейдите к следующей рыбе. Для отслеживания клеточных изменений в течение нескольких дней можно проводить серийную визуализацию с выловом и последующим выпуском согласно инструкциям в прилагаемом письменном документе.

При проведении экспериментов по визуализации с использованием нескольких репортеров предпочтительнее использовать флуорофоры с хорошо разделенными спектрами, однако на практике это не всегда возможно. Здесь мы демонстрируем простой метод вычитания изображений с использованием программного обеспечения с открытым исходным кодом ImageJ для разделения сигналов флуорофоров с перекрывающимися профилями возбуждения и эмиссии. В данном случае речь идет о GFP и YFP.

Методы таймлапс-визуализации, описанные в данном видео, использовались для мониторинга меченных GFP ретинальных стволовых клеток в процессе абляции и регенерации биполярных нейронов сетчатки. Для проведения спектрального разделения собирайте изображения, используя режимы последовательной визуализации и различные настройки барьерных фильтров, что позволяет регистрировать перекрывающиеся флуорофоры независимо и частично разделять их соответственно. После получения изображений используйте импорт Locbio для ImageJ, чтобы открыть файлы изображений и запустить инструмент импорта. Перетащите нужный файл в окно ImageJ.

Разделите каналы на отдельные стеки, используя флажок «split channels» в окне импорта для запуска плагина «align three TP». Перейдите в меню «plugins», затем выберите «align stacks», а после — «align three tp».

Стеки должны быть выровнены для обеспечения правильного вычитания. Выберите эталонный стек в первом выпадающем списке, а смещенный стек — во втором. Установите флажки «use XY relative origin» и «use Z relative origin» и нажмите «okay».

Чтобы начать процесс совмещения, нажмите кнопку регистрации объемов. Появится новое окно с параметрами совмещения. Нажмите «ОК».

Этот раздел был оптимизирован распространителем плагина, поэтому модификации не требуются. По завершении появится окно с выровненными стеками. Чтобы открыть окно вывода, выберите пункт «output» в выровненном окне.

Это окно также оптимизировано и не требует модификации. Нажмите «ОК». В рабочем пространстве появится новый стек, к названию файла которого в конце будет добавлено слово aligned.

Чтобы устранить перекрестные помехи с помощью инструмента «Image Calculator» (Калькулятор изображений), выберите в меню «Process» (Процесс) пункт «Image Calculator». В выпадающем списке «Image One» выберите стек, из которого будет производиться вычитание, а в списке «Image Two» — стек, который будет вычитаться. В выпадающем списке операций выберите «Subtract» (Вычитание) и нажмите «OK».

Image J предложит обработать стек. Выберите «да». Должен появиться новый стек, в котором удалены перекрестные помехи между перекрывающимися каналами.

Объедините стеки, чтобы восстановить структуру изображения, которая была до выравнивания и вычитания. С помощью окна инструментов каналов можно объединить до четырех стеков в один гиперстек. Наконец, раскрасьте каналы, отрегулируйте яркость и контрастность и сохраните файлы в формате tiff для анализа локальной потери и регенерации нитроредуктазы.

Ретинальные биполярные клетки, экспрессирующие M cherry. В отдельных особях данио-рерио до начала обработки была получена серия конфокальных изображений. На снимках представлена мозаичная экспрессия репортера YFP, меченого мембранным тегом, в контрольных биполярных клетках (показаны желтым цветом), и слитого белка нитроредуктазы с cherry в целевых биполярных клетках (показаны красным цветом).

Трансген CFP, меченный мембранным белком (показан голубым цветом), предоставляет контекстную информацию о большинстве других клеток сетчатки для большей наглядности. То же изображение без сигнала CFP показано после обработки метронидазолом. Красные биполярные клетки, экспрессирующие нитроредуктазу, погибают, в то время как желтые контрольные биполярные клетки сохраняются.

Это демонстрирует высокую специфичность данной методики абляции. Для наглядности снова представлено то же изображение без CFP. При удалении metro NIAZ в этой области вновь появляются клетки, экспрессирующие NTR.

На этом рисунке представлен пример метода вычитания G-F-P-Y-F-P на клетках Мюллера, меченных GFP. Глиальные клетки показаны зеленым цветом, а биполярные клетки, меченные YFP, — фиолетовым. Перекрытие двух цветов дает белый цвет, что используется для выполнения вычитания.

Сначала необходимо совместить изображения GFP и YFP. Затем процесс вычитания позволяет удалить меченые YFP биполярные клетки из изображения GFP, что обеспечивает четкое отображение меченых GFP клеток Мюллера и позволяет обнаружить более тусклые клетки Мюллера. Теперь можно проверить перекрытие между тусклыми клетками Мюллера и мечеными M cherry биполярными клетками, показанными красным цветом.

Представленные здесь данные свидетельствуют о том, что абляция биполярных клеток стимулирует клетки Мюлле к замещению утраченных клеток. Такая интерпретация согласуется с недавними исследованиями регенерации сетчатки, в которых клетки Мюлле рассматриваются как индуцированные повреждением предшественники как у млекопитающих, так и у рыб. Данный метод позволяет исследователям изучать механизмы, регулирующие регенерацию конкретных типов клеток, посредством визуализации стволовых клеток у данио-рерио.