Метод мышей Изоляция Островок и субкапсулярной трансплантации почек

Трансплантация островков была предложена в качестве потенциального метода лечения сахарного диабета 1-го типа. Однако две основные проблемы препятствуют ее широкому внедрению в клиническую практику. Во-первых, для одного реципиента требуется большое количество островков.

Поскольку островковые клетки получают от доноров органов, число потенциальных реципиентов крайне ограничено. Повторная трансплантация требует пожизненного приема сильных иммуносупрессоров, что подвергает пациента, особенно в детском возрасте, риску развития злокачественных новообразований, инфекций и почечной недостаточности. Трансплантация островковых клеток под капсулу почки мыши проводится для изучения стратегий по улучшению результатов клинической трансплантации.

Островки, выделенные из мышей-доноров здорового фенотипа, разделены на группы и подготовлены к трансплантации. Затем островки пересаживают в субкапсулярное пространство почки. У мышей-реципиентов с диабетом функцию трансплантата островков оценивают путем мониторинга уровня глюкозы в крови; результаты показывают, что примерно 250–350 островков восстанавливают нормогликемию у мыши-реципиента массой 20 g в течение 24 часов после трансплантации.

Визуальная демонстрация данного метода имеет решающее значение для освоения этапов канюлирования общего желчного протока и переноса глазков в субкапсулярное пространство почки, которые трудно изучить самостоятельно. Эти этапы требуют точной идентификации тканевых структур, твердой руки и применения техники, сводящей к минимуму повреждение тканей.

Поместите эвтаназированную мышь в положение на спине на бумажное полотенце под диссекционным микроскопом и обработайте брюшную полость 70% ethanol. С помощью ножниц вскройте брюшную полость, сделав V-образный разрез от лобковой области к обеим передним конечностям. Мышь находится под диссекционным микроскопом.

Расположите объект так, чтобы голова была направлена к наблюдателю. С помощью гемостатического зажима найдите место впадения общего желчного протока в двенадцатиперстную кишку — дуоденальное отверстие общего желчного протока. Гемостатический зажим должен быть расположен таким образом, чтобы при сжатии он проходил точно по границе между поджелудочной железой и кишечником.

Будут продемонстрированы два метода канюлирования желчного протока: метод свободной руки и метод с помощью пинцета. При использовании метода свободной руки потяните гемостат, зафиксированный на двенадцатиперстной кишке, от головы мыши в сторону хвоста таким образом, чтобы общий желчный проток натянулся.

В желчном протоке рядом с печенью имеется слияние, где соединяются желчь, оттекающая из желчного пузыря, и ферменты из печени. Перед введением в кишечник плотно натяните желчный проток, чтобы обнажить внутреннюю часть V-образного сочленения. Используйте изогнутую иглу 27-го калибра, присоединенную к шприцу объемом 5 мл, чтобы игла прошла прямо через V-образную область и непосредственно канюлировала нижнюю часть протока. Введите иглу на несколько миллиметров дальше конца скоса, чтобы предотвратить обратный ток в печень и желчный пузырь.

После успешного проведения канюляции перфузируйте поджелудочную железу, введя из шприца два миллилитра лиазы. Признаком оптимальной канюляции является расширение поджелудочной железы над желудком. В качестве альтернативы можно провести канюляцию желчного протока.

Используя метод цисты с помощью пинцета. Оттяните гемостат C, зафиксированный на двенадцатиперстной кишке, от головы мыши в сторону хвоста, чтобы общий желчный проток стал извилистым. Затем, используя изогнутую иглу 27-го калибра, прикрепленную к пятимиллилитровому шприцу, проколите фасцию под общим желчным протоком рядом с печенью.

Используя иглу, отделите фасцию от протока, не извлекая иглу. Отложите гемостатический зажим и возьмите пинцет. Одной браншей раскрытого пинцета поддержите желчный проток в месте, где игла отделила фасцию, одновременно выдвигая проток и пинцет вперед.

Введите иглу в проток, используя пинцет в качестве опоры. Признаком успешной канюляции является равномерное расширение области поджелудочной железы над желудком. После перфузии поджелудочной железы удалите гемостат из двенадцатиперстной кишки.

Затем с помощью пинцета приподнимите двенадцатиперстную кишку и с помощью второго пинцета отделите поджелудочную железу от кишечника. Далее освободите поджелудочную железу от верхней части желудка и селезенки. В завершение извлеките поджелудочную железу из брюшной полости, перерезав оставшиеся фасциальные связи с кишечником, желудком и селезенкой.

Поместите поджелудочную железу в коническую пробирку объемом 50 мл и поставьте ее на лед. Инкубируйте поджелудочную железу при 37 °C в соответствии с инструкциями, приведенными в прилагаемом письменном протоколе. После инкубации добавьте в пробирки 20 мл среды и диссоциируйте ткань, энергично встряхнув пробирки 40 раз за 10 секунд.

Этот этап имеет решающее значение для оптимального восстановления фиалок. Центрифугируйте клетки при 800 об/мин. Ресуспендируйте осадок в 15 мл среды и сконцентрируйте образцы.

Пропустите ресуспендированную суспензию через проволочное сито с ячейками 0,419 мм и соберите ее в новый конический центрифужный пробирка объемом 50 мл. Промойте первую пробирку еще 10 мл среды, содержащей 10% fetal bovine serum, и также пропустите ее через сито. Осадите клетки путем центрифугирования, затем ресуспендируйте осадок в 5 мл раствора Histopaque 1077 комнатной температуры. Осторожно перемешайте на вортексе в течение нескольких секунд, добавьте еще 5 мл Histopaque, распределяя раствор по внутренним стенкам пробирки, чтобы смыть клетки со стенок. Медленно нанесите пипеткой 10 мл бессывороточной среды RPMI по стенке пробирки со скоростью 1 мл за 10 секунд.

Должна появиться четкая граница раздела фаз. Затем центрифугируйте образцы в центрифуге с качающимися стаканами при 20 °C и 900 ×g в течение 20 минут с очень медленным ускорением и без торможения после центрифугирования; затем отделите островки от экзокринных клеток с помощью одноразовой серологической пипетки объемом 10 мл. Перенесите островки с границы раздела среды histo Paque в новый конический тубус объемом 50 мл.

На данном этапе можно объединить содержимое нескольких пробирок, чтобы удалить остатки глазков, заполнить пробирки доверху средой с сывороткой и осадить островки, центрифугируя пробирки в течение двух минут при 800 об/мин. Затем снова суспендируйте островки в свежей среде. Повторите этот шаг не менее двух раз.

Ресуспендируйте осадок в 5 мл среды. Поместите нейлоновый стрейнер для клеток с размером пор 0,1 мм отверстием вниз на коническую пробирку объемом 15 мл. Пропипетируйте полученную клеточную суспензию через стрейнер для сбора глазков.

Затем промойте пробирку объемом 50 мл еще 6 мл среды, пропустив жидкость через сито. Поместите каплю среды объемом 3 мл в чашку Петри диаметром 10 см. Переверните сито для клеток и опустите его в каплю среды для сбора эксплантатов, затем пропустите с помощью пипетки дополнительные 5–7 мл культуральной среды через сито в чашку Петри.

Чтобы собрать оставшиеся лютеты из сита под объективом с четырехкратным увеличением, извлеките их по одному с помощью пипетки P 200 и перенесите в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра. На этих изображениях показаны лютеты, выделенные из мышей линии C 57 black six в возрасте 12 недель. Чистоту и качество лютетов можно оценить микроскопически после завершения процедуры выделения.

Например, на двух представленных здесь изображениях показано репрезентативное поле, в котором присутствуют фрагменты тканей и загрязнение экзокринными клетками. При отборе глазков для эксперимента избегайте выбора любых contaminating экзокринных клеток или глазков, которые выглядят нездоровыми. Глазки с некротическими центрами являются нездоровыми, как показано на данном рисунке, сделанном через 24 часа после изоляции; некротические центры не будут видны сразу после изоляции.

Островки, в которых происходит отслоение клеток, неизбежны, и такие островки могут быть использованы при трансплантации, что показано в данном ускоренном 24-часовом видео. Сразу после изоляции во многих островках развиваются некротические центры. В конце записи, во время отбора островков, эти некротические центры, по всей видимости, выталкиваются из островка.

Распределите их таким образом, чтобы в каждой пробирке было равномерное количество люверсов разного качества и размера. Например, каждая группа из 15 люверсов может содержать четыре крупных, шесть средних и пять маленьких люверсов. Поместите пробирку на лед; люверсы можно использовать для трансплантации или дальнейших манипуляций немедленно.

Перед использованием. Поместите стерильный наконечник для нанесения геля в отверстие микроцентрифужной пробирки объемом 1,5 миллилитра так, чтобы в узком конце наконечника образовался плавный изгиб в форме буквы U. Оба отверстия наконечника должны быть направлены вертикально вверх из микроцентрифужной пробирки.

Осторожно извлеките пробирку с айелетами из льда. Убедитесь, что все айелеты осели на дне пробирки. С помощью дозатора P 200 осторожно соберите айелеты с минимальным объемом жидкости со дна пробирки и перенесите их в подготовленный изогнутый наконечник.

После того как островки оседут, максимально удалите среду из кончика, аспирируя ее через большое отверстие наконечника для загрузки геля, содержащего островки, с помощью свежего наконечника для загрузки геля, установленного на пипетку P 200. Присоедините нескошенный конец трубки к узкому отверстию наконечника для загрузки геля с островками. Затем закрепите наконечник на пипетке P 200 и аккуратно вытолкните островки в трубку.

Затем подсоедините нескошенный конец трубки PE 50 к игле шприца Hamilton объемом 25 µL. Оттяните поршень, а затем нажмите его, чтобы переместить глазки на расстояние приблизительно 0.5 cm от скошенного отверстия. Отложите шприц в сторону, чтобы глазки могли собраться в одну массу у скошенного отверстия трубки, пока проводится подготовка почки к введению глазков.

Подготовьте операционное поле, выстригите шерсть и обработайте кожу бетадином, чередуя его с 70% isopropyl alcohol, трижды. Начните процедуру трансплантации глазка, выполнив щипковый тест пальца ноги для подтверждения действия анестезии у мыши-реципиента. Поместите стержень стеклянной палочки непосредственно под мышь, ниже почки и перпендикулярно спинному мозгу.

Затем через кожу найдите почку и застелите область стерильной хирургической салфеткой. После обнаружения почки с помощью ножниц Макферсона сделайте разрез дермы длиной 2 см непосредственно над ней перпендикулярно спинному мозгу. С помощью ножниц этот разрез должен обнажить брюшинную стенку.

Сделайте разрез брюшины длиной один сантиметр в том же направлении, что и разрез дермального слоя, используя стержень стеклянной палочки в качестве опоры; аккуратно вытолкните почку через отверстие в брюшине, надавливая на прилегающую поверхность. Увлажните поверхность обнаженной почки ледяным стерильным PBS с помощью смоченного ватного тампона. Повторяйте эту процедуру каждые несколько минут по мере необходимости, чтобы предотвратить высыхание капсулы почки.

Используя иглу 27-го калибра, сделайте разрез длиной 0,2 сантиметра через капсулу почки на передней поверхности почки. Двигаясь от левой латеральной стороны к правой латеральной стороне, введите стеклянную капиллярную трубку, вытянутую на пламени. Проведите зондирование через ранее сделанный разрез, перемещая трубку в заднем направлении вдоль дорсальной латеральной поверхности почки.

Чтобы создать карман между капсулой и паренхимой почки, сдвиньте люверсы в подготовленном шприце Hamilton объемом 25 milliliter к самому краю скошенного отверстия гибкой трубки. Затем введите трубку скошенным краем вверх в субкапсулярный карман. Длинный край должен контактировать с паренхимой почки.

Переместите трубку к самому заднему краю капсулы. Затем медленно перенесите айлеты из трубки PE 50 в субкапсулярный карман, нажимая на plunger шприца. По мере заполнения кармана айлетами медленно вытягивайте гибкую трубку назад, чтобы освободить больше места.

После извлечения трубки из сумки переместите стеклянный зонд по внешней поверхности почки в направлении от передней к задней части, чтобы аккуратно заправить петли в проксимальный конец сумки. С помощью изогнутого зажима приподнимите брюшинную оболочку рядом с отверстием, сделанным для почки. Затем, используя ватную палочку, смоченную в PBS, аккуратно задвиньте почку обратно в брюшную полость.

Зашейте брюшную стенку мыши с помощью швов, а слой дермы — с помощью зажимов для ран. Поместите мышь обратно в клетку и ведите наблюдение. Для восстановления мыши следует обеспечить доступ к воде с ацетомеином для кишечника.

Были выделены глазные яблоки мышей линии C. С использованием методов, описанных в данном видео, была проведена трансплантация лечебной дозы аллогенным мышам линии C 57 black six. Мониторинг уровня глюкозы в крови натощак проводился начиная с первого послеоперационного дня.

Отторжение наблюдается примерно на 17-й день у мышей-реципиентов весом 20 грамм, которым были пересажены 300 островков от аллогенного донора. Восстановление контролировалось у мышей, получивших либо 150, либо 300 островков от сингенных доноров. При таких трансплантатах отторжение не наблюдается, так как островки получены от сингенных доноров.

Доза пересаженных островков позволяет оценить их основную функцию непосредственно после трансплантации. В то время как при пересадке 150 островков наблюдалось частичное восстановление, при трансплантации 300 островков было достигнуто полное восстановление. После просмотра этого видео вы должны хорошо понимать, как выполнять критически важные этапы, необходимые для выделения островков мыши и их трансплантации в субкапсулярное пространство почки.

С практикой вы разовьете навык быстрого канюлирования общего желчного протока, что является наиболее сложным этапом данного протокола.