Устные Администрации Ротенон использованием принудительного кормления и анализ изображений Альфа-синуклеина включений в кишечной нервной системы

Симптомы болезни Паркинсона, включая двигательные нарушения и расстройства речи, являются следствием снижения активности дофаминсекретирующих клеток головного мозга. Энтеральная нервная система и обонятельная луковица представляют собой наиболее подверженные воздействию нервные структуры и поражаются в первую очередь. Болезнь Паркинсона связывают с воздействием пестицидов.

Для анализа воздействия пестицидов на энтеральную нервную систему мышам пестицид roone вводят путем перорального зондирования. Затем проводят интракардиальную перфузию мозга и энтеральной нервной системы мышей 4% параформальдегидом. Ткани извлекают, подготавливают и окрашивают иммуногистохимически на белки, ассоциированные с болезнью Паркинсона.

Изображения бета-III-тубулина и альфа-синуклеина, полученные с помощью конфокальной микроскопии, демонстрируют накопление альфа-синуклеина внутри нейронов энтеральной нервной системы у животных, подвергшихся воздействию пестицидов. Основное преимущество данного метода по сравнению с существующими подходами, такими как системное введение ротенона, заключается в том, что он обеспечивает ограничение действия ротенона исключительно энтеральной нервной системой. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы о болезни Паркинсона, такие как ее этиология и механизмы, лежащие в основе ее прогрессирования.

Значимость данной методики распространяется на терапию и диагностику болезни Паркинсона, так как она позволит разрабатывать новые терапевтические мишени и диагностические методы. Хотя данный метод может дать представление о патофизиологии болезни Паркинсона, его также можно применять к другим системам, например, при изучении воздействия других токсинов окружающей среды на энтеральную, симпатическую и парасимпатическую нервные системы, а также на стенку кишечника. Как правило, специалистам, которые ранее не использовали данную методику, будет трудно, так как освоение техники зондового кормления требует времени.

Идея этих методов впервые возникла у меня, когда я прочитал о связи между пестицидами и болезнью Паркинсона. Также полезным стало посещение конференции CORA на Всемирном конгрессе по болезни Паркинсона в Берлине в 2005 году. Необходима наглядная демонстрация этого метода.

Метод введения ol с помощью зондового кормления затруднен из-за того, что анатомия мышей отличается от анатомии человека; с другой стороны, анализ изображений проводился с использованием специально адаптированных этапов для данных снимков. Начните протокол с взвешивания животного. Рассчитайте соответствующий объем ротенона.

На один грамм веса животного требуется 0,01 миллилитра, что соответствует дозе роона 5 миллиграмм на килограмм. Наберите раствор роона в шприц объемом один миллилитр, затем наберите раствор растворителя во второй шприц. Возьмите мышь, удерживая её за хвост одной рукой.

Растяните кожу шеи, потянув её указательным и средним пальцами другой руки. Зафиксировав голову между двумя пальцами, прижмите её к ладони и переверните вверх дном. Зафиксируйте хвост.

Используя четвертый и пятый пальцы, прижимая голову к задней части, надавите на небо, чтобы открыть рот мыши. Осторожно введите зонд для гаважа в рот. Медленно продвигайте зонд в направлении желудка до полного введения его всей длины.

Чтобы предотвратить попадание вещества в легкие, введите раствор roone или плацебо, осторожно нажимая на шприц. По завершении медленно извлеките зонд и поместите животное в другую клетку, пока не будет обработано все животное из одной клетки. После проведения процедуры мышам проводят внутрисердечную перфузию 4% параформальдегидом.

В PBS путем диссекции извлекают кишечник, который затем помещают в 15% sucrose на ночь. На следующий день ткань переносят в 30% sucrose и снова инкубируют в течение ночи при температуре four degrees Celsius. Затем ткань помещают в морозильную камеру при температуре minus 80 degree Celsius и хранят до использования. С помощью криостата делают срезы кишечника толщиной 20 micron.

Срезы переносят на предметные стекла, после чего проводят процедуры блокировки и иммуноокрашивания. Затем используют антитела к бета-III-тубулину и антитела к альфа-синуклеину. Рекомендуется, чтобы анализ данных проводил сторонний специалист в режиме «слепого» исследования.

Для начала анализа откройте программное обеспечение Fiji. Откройте файл с конфокальным изображением. Затем разделите каналы, чтобы иметь возможность работать с каждым каналом независимо.

Закройте каналы, которые не будут использоваться, затем выберите Analyze, Set Scale и установите размер пикселя равным 1. Установите известное расстояние на 0.13 и нажмите Global. Теперь размер изображения будет отображаться в микронах.

Выберите канал альфа-синуклеина и выделите ганглий. Убедитесь, что выделение охватывает ганглий на всех срезах. Дублируйте изображение с выделенным ганглием — будет создана копия изображения размером с ганглий.

Нажмите «edit clear», после чего область изображения за пределами выбранного региона станет черной. Снова продублируйте изображение, чтобы определить эффективность процедуры. Изображения с низким соотношением сигнал/фон не следует использовать для анализа.

Выберите «Image» (Изображение), затем «Adjust Threshold» (Настройка порога). После этого выберите «Max Entropy» (Максимальная энтропия). Затем просмотрите срезы на обрезанном и оригинальном изображениях, чтобы убедиться в правильности выполнения процедуры.

Тропический порог выбирает уровень сигнала интенсивности на основе гистограммы изображения, и в процессе выбора изображения в черно-белом режиме будут отображаться только те пиксели, интенсивность которых выше этого порога. Затем нажмите smooth. Этот шаг преобразует пикселизированные края изображений в сглаженные края в процессе выбора.

Затем нажмите на «binary» и выберите «Make binary». Изображение будет отображаться в черно-белом цвете; чтобы выполнить следующий шаг на дубликате, создайте копию изображения, нажмите на «analyze», а затем — «analyze particles». После этого выберите «show outlines» и нажмите «summarize».

Остальные настройки следует оставить по умолчанию. Эта функция определяет общее количество пикселей с сигналом, а также объединяет их в общую площадь пикселей с сигналом. Кроме того, выводятся количество групп пикселей и их средний размер.

Сравните и выберите срез с наибольшей общей площадью, который хорошо прилегает. Этот срез будет отмечен. Скопируйте таблицу данных с указанием общей площади поверхности alpha synuclein, количества включений и среднего размера частиц.

Вставьте данные в таблицу Excel или зафиксируйте их другим способом. Вернитесь в Fiji. Найдите ранее выбранный срез в канале бета-тубулина и выберите его.

Выберите область ганглия и нажмите «analyze». Затем выберите «measure». Появится еще одна таблица с указанием общей площади поверхности ганглия.

Перенесите данные из таблицы в электронную таблицу Excel рядом с результатами измерения альфа-синуклеина или скопируйте их в другой документ с помощью Excel. Разделите различные параметры, полученные при измерении альфа-синуклеина, на площадь ганглия, чтобы получить общую площадь альфа-синуклеина и количество включений, нормированное по размеру ганглия. Для анализа эффектов ротенона, действующего локально на энтеральную нервную систему, однолетним мышам линии C 57 black six вводили пестицид ротенон в дозе 5 mg/kg путем перорального зондирования. Представленная здесь хроматограмма демонстрирует наличие пика ротенона через один час после введения; контрольные мыши получали 20 mg/kg ротенона, а также 10 и 5 mg/kg ротенона.

Уровни ротенона в экстрактах крови, головного мозга и ствола мозга определяли методом ВЭЖХ, как показано здесь. Введение ротенона в дозе 5 mg/kg путем перорального зондирования не приводит к появлению измеримых уровней препарата в крови через один, два или три часа после обработки, согласно данным ВЭЖХ. На этом графике показаны уровни ротенона в головном мозге и стволе мозга обработанных мышей.

Через один час после введения ротенона в дозе 10 мг/кг или менее в образцах головного и продолговатого мозга уровни ротенона не обнаруживаются. Через один час после введения была проведена оценка активности митохондриального комплекса I в образцах мышц и мозга мышей в возрасте 1,5 месяца. Между группами не наблюдалось значимых различий, что свидетельствует об отсутствии ингибирования митохондриального комплекса I и подтверждает отсутствие ротенона в данных областях.

Анализ альфа-синуклеина, компонента телец Леви при болезни Паркинсона, после введения rone позволяет достоверно определить общее количество альфа-синуклеина на поверхности, наличие включений альфа-синуклеина и характер распределения альфа-синуклеина в клетке. На данном рисунке показано окрашивание на анти-бета-III-тубулин, альфа-синуклеин и DAPI в срезах двенадцатиперстной и подвздошной кишки, как видно здесь. Лечение roach в течение 1,5 месяцев вызвало усиление пунктирного паттерна альфа-синуклеина внутри ганглиев энтеральной нервной системы, даже по сравнению с контрольной группой через три месяца.

Данная картина наблюдается как в подвздошной, так и в двенадцатиперстной кишке. После трех месяцев лечения при иммунофлуоресцентном окрашивании с использованием антител к alpha synuclein, theof, flavin и DPI обнаруживается образование более крупных включений alpha synuclein; агрегация более крупных скоплений alpha synuclein наблюдается только через три месяца. Анализ результатов данного эксперимента проводился с использованием методов автоматической сегментации и пороговой обработки на основе энтропии.

На графике слева каждый столбец представляет собой отношение общей площади поверхности альфа-синуклеина к площади поверхности ганглия. На графике справа каждый столбец представляет собой общее количество включений альфа-синуклеина на взятой площади поверхности ганглия. В совокупности эти данные свидетельствуют о том, что местное введение ротенона вызывает фосфорилирование, накопление и агрегацию альфа-синуклеина с развитием глиоза в ганглиях энтеральной нервной системы. После освоения данной методики её выполнение занимает одну минуту на одно животное при условии правильного проведения процедуры.

При выполнении данной процедуры важно вводить зонд для гаважа осторожно; при обнаружении любых препятствий рекомендуется извлечь его и повторить введение, следуя описанным этапам. Могут быть применены и другие методы, такие как ВЭЖХ, иммуногистохимическое окрашивание и анализ изображений. Это позволит исследовать другие области, изучить эффекты вещества или даже определить его присутствие в крови после введения.

Этот метод открыл нейробиологам путь к исследованию воздействия нейротоксинов окружающей среды на энтеральную нервную систему. После просмотра этого видео вы сможете правильно использовать калибр и анализировать изображения, полученные в результате иммунохимического анализа. Не забывайте, что работа с гнилыми образцами может быть чрезвычайно опасной.

Поэтому при выполнении данной процедуры мы рекомендуем использовать перчатки и маски.