Визуализация личинок Сегментные Нервы у 3 ^Й Инстар Drosophila Подготовка личинок

Аксональный транспорт можно изучать путем визуализации сегментарных нервов личинки. Личинка drosophila третьей стадии развития. Сначала проводят диссекцию личинки, чтобы обнажить ЦНС, не повреждая оптические доли, вентральный ганглий и сегментарные нервы.

Вторым этапом процедуры является фиксация лавы в формальдегиде перед инкубацией с первичными антителами в течение ночи и со вторичными антителами в течение одного часа в темноте. Затем лаву монтируют на предметное стекло для изучения дефектов аксонального транспорта. Локализация и распределение белков могут быть исследованы с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии.

Хотя этот метод позволяет получить представление об аксональном транспорте, его также можно применять к другим системам, таким как морфология синапсов и мышц. Как правило, лица, впервые использующие данный метод, сталкиваются с трудностями, так как на начальном этапе сложно выполнить допустимую диссекцию, особенно при необходимости сохранить целостность сегментарных нервов и мышц головного мозга. Для начала процедуры приготовьте 1× фиксирующий буфер для диссекции, 1× PBT и 5% раствор BSA.

В соответствии с таблицей, представленной перед началом диссекции, подготовьте чистый набор пинцетов номер пять, чистый набор ножниц с прямыми лезвиями и булавки для проведения диссекции; используйте микроложечку для сбора блуждающих личинок третьего возраста с определенным генотипом в чашку Петри. Затем промойте личинок в чашке Петри с деионизированной водой, чтобы удалить остатки корма.

Затем поместите личинку на чашку Петри дорсальной стороной вверх. Закрепите личинку булавками в переднем и заднем концах. С помощью тонкого пинцета нанесите каплю одноразового диссекционного буфера на закрепленную личинку.

Сделайте надрез на дорсальной срединной линии лавы вблизи заднего конца. С помощью ножниц разрежьте кутикулу лавы от заднего конца до переднего. Нанесите каплю 1-кратного диссекционного буфера на препарированную лаву.

С помощью булавки подцепите один боковой край кутикулы примерно посередине личинки и закрепите кутикулу другой булавкой. Таким же образом закрепите второй боковой край кутикулы; как показано на схеме, с каждой боковой стороны используются две булавки. Теперь осторожно удалите кишечник, жировые тела и трахеи, оставив только мозг с двумя оптическими долями и брюшными ганглиями.

После фиксации сегментарных нервов и их прикрепления следующим этапом проводят окрашивание антителами, пока личинки закреплены в защитной чашке. Инкубируйте препарированные личинки в 50 µL фиксатора в течение 30 минут. После фиксации, заменяя фиксатор каждые 15 минут, промойте личинки в одном объеме PBT в течение 30 минут.

При замене буфера каждые 10 минут важно следить за тем, чтобы личинки всегда оставались погруженными в буфер. Приготовьте раствор первичных антител, разбавив их до соответствующей концентрации в 5% BSA растворе. Оптимальные концентрации различаются для разных антител.

Создайте увлажненную камеру, застелив пластиковую чашку салфеткой Kim. Wipe, смоченной в воде. Замените последнюю один раз PBT.

Промойте препараты подготовленным раствором первичных антител и инкубируйте в увлажненной камере при температуре 4 °C в течение ночи. Промойте препарированные личинки в 1× PBT в течение 30 минут, заменяя буфер каждые 10 минут. Подготовьте раствор вторичных антител, разведя их до соответствующей концентрации в 5% растворе BSA.

Оберните увлажненную камеру фольгой, так как некоторые вторичные антитела чувствительны к свету. Инкубируйте личинок в растворе вторичных антител при 25 °C в течение одного часа. По завершении инкубации с вторичными антителами промойте личинок в одном объеме PBT в течение 30 минут, заменяя буфер каждые 10 минут, после чего приступайте к фиксации и визуализации препарированных личинок перед их помещением на предметное стекло.

Подготовьте предметное стекло, нанеся в центре две вертикальные линии лака для ногтей с достаточным расстоянием между ними для размещения покровного стекла, как показано на схеме. Дайте лаку для ногтей полностью высохнуть. Нанесите каплю монтажного буфера в пространство между вертикальными линиями лака на предметном стекле, как показано на этом изображении.

Предстекло теперь готово к монтированию. Извлеките личинок после того, как последняя из них пройдет PBT. Промойте их и осторожно удалите латеральные булавки из личинки.

Будьте осторожны, чтобы не разорвать кутикулу. Извлеките два оставшихся зажима, подхватите личинку пинцетом и поместите ее на подготовленный предметный слайд. Убедитесь, что личинка не перевернута и ориентирована вентральной стороной вверх.

Аккуратно положите сверху покровное стекло стороной вверх и загерметизируйте края лаком для ногтей, как показано здесь. Теперь личинки готовы к визуализации под флуоресцентным микроскопом. Это репрезентативное изображение личинки дикого типа, окрашенной антителами к белку синаптических везикул — цистин-стринг-белку.

Сегментарные нервы мухи дикого типа окрашены равномерно. Здесь показан мутант по моторному белку lava, окрашенный антителами к CSP. В сегментарных нервах наблюдаются массивные скопления, которые ярко окрашиваются на CSP.

При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости сохранения сегментарных нервов, прикрепленных к мозгу, и целостности мышц. После просмотра этого видео вы должны хорошо освоить технику диссекции. Зафиксируйте личинок для иммуноокрашивания и выделите сегментарные нервы для изучения аксонального транспорта с помощью флуоресцентного микроскопа.