Одноместный Трансфекция сотовый на куриных эмбрионах
25 сентября 2010 г.
Использование тонких кончика микропипетки мы вводим плазмиды ДНК в подобластях куриного сомитов или нервных трубок. Концентрация плазмиды регулируется для получения одного трансфекции клеток. Затем мы позволить клеткам развиваться в клональных популяций.
Общая цель данной процедуры заключается в инъекции плазмиды, кодирующей зеленый флуоресцентный белок, в отдельные клетки сомитов или нейральных трубок цыпленка. Это достигается путем предварительного вытягивания микроинъекционных пипеток с соответствующим диаметром отверстия наконечника. Вторым этапом процедуры является подготовка стокового раствора плазмиды для инъекций.
Третьим этапом процедуры является подготовка эмбрионов к инъекции. Четвертый этап процедуры заключается в наполнении микропипеток плазмидной ДНК. Заключительным этапом процедуры является инъекция в нужные ткани.
В конечном итоге с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии можно получить результаты, демонстрирующие диапазон производных в количестве клеток, образованных одиночными мечеными предшественниками в выбранных субдоменах сомитов и нейральной трубки. Здравствуйте, я Раэль из лаборатории профессора Хайма на кафедре медицинской нейробиологии Еврейского университета в Иерусалиме. Сегодня мы продемонстрируем вам процедуру инъекции одиночных клеток в сомиты и нейральные трубки цыпленка.
Мы используем эту процедуру в лаборатории для изучения сегрегации линий клеток сомитов и нервной трубки. Приступим к работе. Для получения единичных трансфецированных клеток в эмбрионах цыплят начните с вытягивания микропипеток. Мы вытягиваем пипетки на стандартном вытягивателе пипеток Naga PP 83 при настройке нагрева 13,5.
Необходимо точно откалибровать настройки, чтобы добиться диаметра кончика пипетки от 8 до 10 мкм. Мы используем филамент, содержащий боросиликатные стеклянные трубки с внешним диаметром 1 мм и внутренним диаметром от 0,75 до 0,78 мм. Также можно использовать имеющиеся в продаже микропипетки, не имеющие филамента с внешним диаметром 1 мм и внутренним диаметром 0,75 мм.
Подготовленные пипетки хранят в пластическом кювете так, чтобы наконечники были защищены от контакта с краем кювета. Для подготовки ДНК к микроинъекции целевую плазмиду трансфицируют в штамм *E. coli* DH5α. На следующий день, используя стандартные процедуры, плазмиду очищают с помощью набора Maxi prep; для неклональных инъекций используют концентрацию ДНК 1 µg/µL.
Для экспериментов, в которых требуются отдельные клоны, концентрация плазмиды должна быть значительно ниже, поэтому ее потребуется скорректировать. Для P-C-A-G-G-F-P-A хорошо подходит концентрация от 0,05 до 0,1 microgram per microliter. После определения оптимальной концентрации мы рекомендуем разводить весь очищенный сток плазмиды до заданной концентрации, а не подготавливать отдельные порции.
Последнее может привести к определенной вариабельности показателей успеха, вероятно, из-за различий в чистоте и других параметрах, таких как доля суперскрученной плазмиды. Для подготовки яиц к микроинъекциям куриные яйца, которые инкубировались в горизонтальном положении до достижения нужной стадии развития, протирают 70% этанолом и дают им высохнуть. Затем острый конец яйца прокалывают хирургическими ножницами. С помощью шприца объемом 10 мл и иглы 19G из яйца извлекают 2 мл альбумина, после чего отверстия запечатывают горячим парафином перед проведением инъекции.
С помощью хирургических ножниц прорежьте окно в верхней части скорлупы яйца, чтобы предотвратить попадание мусора в отверстие. Наклейте на окно кусочек скотча и прорежьте в нем отверстие. Для лучшей визуализации эмбриона используйте вытянутый нагревом капилляр, установленный на аспираторе, чтобы ввести нетоксичные чернила, такие как pelican 17, под бластную дерму.
Затем обеспечьте доступ к эмбриону, разрезав и отодвинув вителлинную и/или амниотическую оболочки с помощью энтомологических булавок диаметром 0,14 мм, закрепленных в иглодержателе, чтобы ввести ДНК в вытянутую пипетку Eloqua, и с помощью капилляра добавьте небольшое количество порошка fast green. Наберите минимальный объем плазмиды в капилляр соответствующего диаметра с помощью аспиратора. Затем вставьте его в конец пипетки, противоположный острому концу, и загрузите ДНК как можно ближе к острому концу.
Затем закрепите пипетку в ручном инжекторе с пневматическим приводом, установленном на микроманипуляторе. При необходимости приложите минимальное давление, чтобы плазмидный раствор достиг кончика пипетки. Переместите пипетку в жидкую среду яйца, создавая при этом небольшое давление воздуха, чтобы предотвратить закупоривание кончика пипетки.
Как только игла пройдет через соответствующий участок ткани, изменения давления часто бывает достаточно для высвобождения плазмиды с видимым красителем fast green. Если этого не произойдет, слегка надавите на шприц, пока смесь плазмиды и fast green не будет введена. Повторите эту процедуру вдоль оси эмбриона; после инъекции можно добавить PBS.
Наконец, закройте окно с помощью клейкой ленты и верните яйца в инкубатор. Избегайте вентиляции и поместите в инкубатор небольшие контейнеры с водой, чтобы помочь поддерживать влажность и увеличить выход жизнеспособных эмбрионов. Если место инъекции было достаточно поверхностным, чтобы быть легко заметным (например, в дорсальных сомитах, нервной трубке или эктодерме), можно оценить успех эксперимента, проведя наблюдение всего препарата с помощью флуоресцентного бинокуляра.
Этот этап особенно полезен для оценки того, было ли помечено слишком много или слишком мало клеток. Если требуется дальнейшая инкубация, после осмотра добавьте в яйцо раствор антибиотиков в PBS и снова закрепите верхнюю часть специальной лентой. Кроме того, можно оценить эффективность инъекции путем серийного среза эмбрионов и проведения иммуногистохимического анализа.
Спустя четыре или более часов после инъекции эмбрионы фиксируют и подготавливают к заливке в парафин для изготовления срезов. Срезы, закрепленные на стекле, депарафинизируют и подвергают иммуноокрашиванию для визуализации репортера; при этом могут потребоваться методы усиления сигнала, такие как биотинилированный стрептавидин. Наконец, серийные срезы сканируют для обнаружения меченых клеток в инъектированных сегментах.
Если при первых попытках вместо одиночных клеток образуются группы клеток, необходимо развести сток плазмиды и повторить процедуру до достижения надлежащих результатов. Обычно мы выполняем одну инъекцию P-C-A-G-G-F-P на один сомит, охватывая от шести до 12 сегментов на один эмбрион. При таких условиях четкий сигнал можно обнаружить при анализе всего препарата (whole mount) через восемь часов после инъекции по крайней мере в одном сегменте одного эмбриона из 10.
В данном примере в сомиты была введена плазмида, кодирующая GFP, и спустя пять часов в целом препарате эмбриона, показанном здесь, наблюдается одна флуоресцентная клетка. При наблюдении через 24 часа после инъекции в центральный сомит в целом препарате эмбриона через два дня после клональной инъекции наблюдается клон флуоресцентных клеток. Срезы данного сегмента выявляют наличие клонального потомства как в дерме, так и в мышцах, что доказывает, что единичные клетки-предшественники дают начало обоим производным.
Что касается сомитов, одиночные нейроэпителиальные предшественники в дорсальной части нейральной трубки также могут быть проколоты, как показано на данном поперечном срезе, фотография которого была сделана через пять часов после инъекции. Анализ серийных срезов показал, что клональная трансфекция была достигнута при эффективности около 10%. Это означает, что для обеспечения клональности данный метод по определению является крайне неэффективным. С другой стороны, в этих условиях было установлено, что более 93% случаев положительного мечения были клональными.
Мы только что продемонстрировали вам способ инъекции в отдельные клетки эмбрионов цыпленка при выполнении данной процедуры. Важно помнить, что большой объем исходного раствора плазмиды необходимо развести до оптимальной концентрации для заражения отдельных клеток, а затем использовать этот раствор на протяжении всех ваших экспериментов. На этом всё.
Благодарим за просмотр и желаем успехов в ваших экспериментах.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье описывается метод инъекции плазмидной ДНК в отдельные клетки сомитов или нервных трубок цыпленка с использованием микропипеток с тонким кончиком. Целью является создание клональных популяций трансфицированных клеток, экспрессирующих зеленый флуоресцентный белок.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронаука
- Клеточная биология
- Генная инженерия
Теоретические основы
- Методы микроинъекций имеют важное значение для изучения функций генов.
- В качестве модельного организма часто используют эмбрионы курицы.
- Для визуализации может быть использована плазмидная ДНК с целью экспрессии флуоресцентных белков.
- Трансфекция единичных клеток позволяет проводить анализ клональных популяций клеток.
Цель исследования
- Разработка надежного метода введения плазмидной ДНК в определенные ткани.
- Получение одиночных трансфицированных клеток для дальнейшего изучения.
- Обеспечение возможности наблюдения за экспрессией генов в живых эмбрионах.
Используемые методы
- Подготовка микроинъекционных пипеток с подходящим диаметром кончика.
- Приготовление стоковых растворов плазмид для инъекций.
- Подготовка эмбрионов цыпленка для микроинъекций.
- Инъекция плазмидной ДНК в сомиты или нервные трубки.
Основные результаты
- Успешное введение плазмидной ДНК в целевые ткани.
- Получение единичных трансфицированных клеток, которые развиваются в клональные популяции.
- Визуализация экспрессии гена с помощью зеленого флуоресцентного белка.
- Разработка протокола для будущих исследований функции гена.
Выводы
- Метод микроинъекций эффективен для трансфекции отдельных клеток.
- Данный метод может быть применен в различных исследованиях в области биологии развития.
- Будущие исследования могут опираться на эти результаты для изучения функций генов in vivo.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Трансфекция единичных клеток в эмбрионах цыпленка позволяет осуществлять точное отслеживание клеточных линий и генетические манипуляции, что способствует валидации мишеней в путях развития. Данный метод обеспечивает снижение механистических рисков путем установления связи между поведением клеток-предшественников и фенотипическими результатами, что позволяет принимать обоснованные решения на ранних этапах поиска. Его воспроизводимость и количественный клональный анализ повышают прогностическую достоверность в доклинических модельных системах.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишеней
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем отслеживания клонального потомства от единичных клеток-предшественников в субдоменах сомитов и нейральной трубки.
- Операционная ценность: способствует снижению биологических рисков за счет прямой визуализации производных типов клеток (например, дермы и мышц), происходящих от меченых предшественников.
- Стратегическая ценность: облегчает отбор приоритетных проектов в портфеле путем сравнения генетически модифицированных клональных популяций с контрольными группами для оценки функциональности мишени.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Подготовка валидированных биологических систем для последующих этапов анализа путем спорадической трансфекции единичных клеток в определенных областях ткани.
- Практическая ценность: Обеспечение стандартизации и воспроизводимости анализа за счет контролируемой концентрации плазмиды (0,05–0,1 µg/µl для клонального мечения) и согласованных параметров микроинъекций.
- Стратегическая ценность: Повышение эффективности скрининга за счет обеспечения масштабируемого и совместимого с платформой прослеживания клеточных линий в нескольких сегментах эмбриона (6–12 на один эмбрион).
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Соответствует моделям заболеваний за счет моделирования клональной динамики при эмбриогенезе позвоночных, что актуально для исследования врожденных нарушений.
- Операционная ценность: Обеспечивает трансляционную преемственность от этапа открытия до доклинической валидации с помощью иммуногистохимии и анализа серийных срезов трансфицированных сегментов.
- Стратегическая ценность: Обосновывает решения по продвижению проекта с учетом рисков путем количественной оценки показателей успеха клонирования (~10% трансфекции, >93% клональности среди положительных образцов) для планирования масштабирования экспериментов.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод интегрируется в непрерывный процесс исследований: от проверки гипотез на ранних этапах изучения биологии до идентификации перспективных соединений посредством клонального функционального анализа и доклинических работ с использованием лонгитюдного отслеживания фенотипа.
- Фундаментальная биология: способствует проверке гипотез, обеспечивая отслеживание линий единичных клеток-предшественников для выяснения диверсификации судеб клеток в линиях сомитов и нервной трубки.
- Скрининг: обеспечивает готовность анализа за счет воспроизводимого изготовления микропипеток (диаметр кончика 8–10 µm) и стандартизированных протоколов загрузки ДНК.
- Аналитика: предоставляет количественные данные с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии и сканирования срезов для измерения клональной экспансии и вклада производных клеток с течением времени.
- Трансляционные исследования: обеспечивает преемственность с доклиническими исследованиями, позволяя сравнивать манипулированные клональные популяции с контрольными группами в течение трех дней после инъекции.
- Повторное использование в организации: функционирует как многократно используемый метод в различных исследованиях благодаря стандартизированным рабочим процессам подготовки эмбрионов, калибровки пипеток и разведения плазмид.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Прогностическая уверенность в валидации мишени, снижение механистической неопределенности в отношениях между линиями.
- Операционная ценность: Стандартизация, воспроизводимость и масштабируемость трансфекции единичных клеток на различных этапах развития.
- Стратегическая ценность: Обоснованность принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go), эффективность использования капитала и снижение биологических рисков на поздних этапах за счет раннего клонального фенотипирования.
- Влияние на портфель: Приоритизация с учетом рисков и принятие решений о продвижении проектов на основе количественных показателей получения клонов.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с вытягивателем микропипеток и манипуляциями с эмбрионами для достижения диаметра кончика 8–10 µm и успешного проникновения в ткани.
- Необходимое оборудование включает микроманипулятор, инжектор с пневматическим приводом и флуоресцентный микроскоп для клонального трекинга.
- Стандартизация между исследовательскими группами требует единообразного разведения плазмид (например, 0.05–0.1 µg/µl) и протоколов стадирования эмбрионов для обеспечения воспроизводимости показателей трансфекции.
- При адаптации метода для различных модельных систем необходимо корректировать давление инъекции и концентрацию ДНК в зависимости от доступности тканей и геометрии эмбриона.
- Практические ограничения включают низкую эффективность трансфекции (~10%), что обуславливает необходимость разведения стокового раствора и повторных инъекций для достижения разрешения на уровне одной клетки.
