Выражение, детергентов солюбилизации и очистки Мембранные Transporter, сопротивление MexB множественной лекарственной белка

Для очистки мембранного белка Mex B сначала проводят экспрессию Mex B в e coli с использованием методов рекомбинантной ДНК. Затем выделяют мембраны, и мембранные белки солюбилизируют с помощью мягкого детергента. Солюбилизированный мембранный белок очищают с помощью iMac, после чего проводят дополнительную очистку белка методом гель-фильтрационной хроматографии.

Степень очистки белка определяют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле с SDS. Хотя данная процедура позволяет получить представление о трансмембранных транспортерах множественной лекарственной устойчивости, ее также можно применять к другим мембранным белкам; сегодня процедуру продемонстрирует аспирант из моей лаборатории. Для данной процедуры Mex B из Pseudomonas aeruginosa будет субклонирован в экспрессионный вектор PET 30 B плюс, чтобы Mex B экспрессировался с C-концевым HEXA-гистаминовым тегом. Вечером инокулируйте четыре культуры в 3 мл среды LB с канамицином свежими трансформантами или используйте замороженный сток; культивируйте культуры на роллере при 37 °C в течение ночи.

Используйте ночные культуры для инокуляции 150 миллилитров среды LB, содержащей 30 микрограмм на миллилитр канамицина; выращивайте культуру при 37 градусах Цельсия на шейкере в течение дня. Используйте полученную малую культуру для инокуляции шести флаконов по одному литру среды XYT, содержащей 30 микрограмм на миллилитр.

Добавьте канамицин в колбы с папоротником. Используйте 25 миллилитров на одну культуру для разведения 1 к 40. Культивируйте образцы при 37 °C до достижения определенной оптической плотности.

600 от 0,4 до 0,6, около 1,5 часов. Когда культуры достигнут соответствующей плотности, индуцируйте экспрессию белка, добавив 0,5 миллилитра одного молярного IPTG. Верните все колбы в шейкер и продолжайте их выращивание при 30 °C в течение ночи до сбора бактерий на следующее утро.

Достаньте культуры из шейкера и охладите их. Затем для сбора клеток перенесите культуры в центрифужные пробирки и центрифугируйте при температуре 4 °C в течение 30 минут при 5 000 об/мин в центрифуге большого масштаба. Пока клетки центрифугируются, добавьте в 100 мл буфера для ресуспендирования клеток ингибиторы протеаз DNAs и лизоцим.

Также дополните две аликвоты буфера для ресуспендирования мембран ингибиторами протеаз, как показано в этой таблице. После завершения центрифугирования держите все три раствора на льду. Ресуспендируйте осадки клеток в 100 миллилитрах буфера для ресуспендирования клеток.

Затем перейдите к экстракции клеток. Суспензию клеток загружают в камеру высокого давления French, которую затем устанавливают в пресс French. Давление подают до достижения значения 12,000 pounds per square inch.

Клапан открывают совсем немного, чтобы разрушенные клетки вытекали тонкой струйкой. Важно не открывать клапан слишком широко, чтобы клетки не выплескивались, поскольку в таком случае они будут высвобождаться при слишком низком давлении и не будут эффективно разрушены. Соберите лизат клеток в бутыль, которую следует поддерживать в охлажденном состоянии на льду.

Повторно пропустите клеточный раствор через пресс французского типа при давлении 12, 000 psi. Перенесите клеточный лизат в центрифужные пробирки SS 34 и центрифугируйте для удаления клеточного дебриса при 10, 000 об/мин в течение 30 минут при температуре 4 °C с использованием ротора SS 34. Далее следует очищенный лизат.

Используется для подготовки мембранной фракции. Осторожно перенесите супернатант в ультрацентрифужные пробирки TI 6 4, 7 0.5, центрифугируйте в роторе TI 6 4 7 0.5 при 40,000 об/мин в течение 50 минут при температуре четырех градусов Цельсия.

Удалите супернатант. С помощью пипетки осторожно ресуспендируйте осадок, содержащий клеточные мембраны, примерно в 25 миллилитрах буфера для ресуспендирования мембран. Перенесите суспензию мембран в чистую центрифужную пробирку и центрифугируйте повторно в роторе TI I 6 4 7 0.5 при 40 000 об/мин в течение 50 минут при температуре 4 °C, после чего ресуспендируйте промытый мембранный осадок в 25 миллилитрах буфера для ресуспендирования мембран. Затем солюбилизируйте мембранные белки в ресуспендированных мембранах, добавив около 25 миллилитров.

Добавьте шесть миллилитров 10% DDM так, чтобы конечная концентрация детергента составила 2% DDM; перемешивайте смесь путем покачивания при температуре four degrees Celsius в течение двух часов. После двухчасовой инкубации в присутствии DDM центрифугируйте смесь при 40 000 оборотов в минуту в течение 40 минут при four degrees Celsius с использованием ротора TI I 6 4 7 0.5, чтобы отделить растворимые белково-детергентные комплексы от нерастворимых белков. Сохраните супернатант, содержащий белково-детергентные комплексы Mex B, для использования при очистке. Смешайте супернатант, содержащий белково-детергентные комплексы Mex B, с двумя миллилитрами ионообменных металлоаффинных бусин, уравновешенных в буфере для ресуспендирования (Resus suspension Buffer); инкубируйте в течение одного часа на роллере при four degrees Celsius для связывания белков с смолой.

Перелейте суспензию в корпус колонки для гравитационного потока и слейте прошедшую жидкость. Промывайте колонку 20 миллилитрами или 10 объемами колонки буфера для связывания и промывки iMac до завершения процесса промывки. Элюируйте связавшиеся белки 10 миллилитрами элюционного буфера iMac.

Возьмите пробы объемом 10 µL каждой фракции элюата. Смешайте их с 10 µL двухкратного SDS-буфера для образцов и проведите анализ с помощью 10% полиакриламидного SDS-геля.

Оцените количество и чистоту mex B в каждой фракции. Соберите фракции, содержащие белково-детергентные комплексы Mex B, и сконцентрируйте их с помощью спинового концентратора при температуре четырех градусов Цельсия. Будьте осторожны, чтобы на этом этапе белок не выпал в осадок.

Выполните несколько коротких центрифугирований и следите за появлением осадка. После каждого центрифугирования приступайте к очистке объединенных фракций с помощью колонки для гель-фильтрации. Предварительно уравновесьте колонку Superose 12 HL 30 10 мл 24 миллилитрами рабочего буфера и дождитесь установления стабильной базовой линии.

Затем промойте контур загрузки системы актора проточным буфером. Перед нанесением белка на колонку профильтруйте белковый раствор с помощью шприцевого фильтра. Затем нанесите на колонку до 240 µL белкового раствора с концентрацией белка до 5 mg/mL.

Пропустите через колонку 1,5 объема буфера, собирая фракции по 0,25 миллилитра. Белково-детергентные комплексы XB элюируются в виде пика при объеме элюции примерно от 10 до 15 миллилитров. Возьмите образцы по пять микролитров из пиковых фракций.

Смешайте каждую пробу в соотношении один к одному с двухкратным буфером для образцов с SDS. Проанализируйте образцы на 10% полиакриламидном геле, чтобы оценить количество и чистоту MexB в каждой фракции, и выделите фракции, содержащие чистый MexB. На данный полиакриламидный гель были нанесены выделенные фракции из колонки iMac и отдельные фракции из колонки для гель-фильтрации. После гель-фильтрации белок выглядит чистым на полиакриламидном геле, окрашенном кумасси.

На графике гель-фильтрации виден основной пик белково-детергентного комплекса, выходящего из колонки. Средний выход белка mxb составляет примерно два миллиграмма на шесть литров культуры XYT 2X. При наличии соответствующего навыка данная процедура может быть выполнена за восемь часов при условии правильного соблюдения всех этапов. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как экспрессировать, сольватировать и очистить мембранный белок.