Визуализация Митохондриальная ДНК репликации в отдельных клетках путем усиления сигнала EDU

Общая цель данной процедуры заключается в маркировке и визуализации репликации мтДНК в культивируемых нейронах. Это достигается путем первоначальной инкубации нейронов с тимидиновым аналогом EDU в течение от 2 до 24 часов. Вторым этапом процедуры является маркировка EDU, содержащего алкин, флуоресцентным красителем Oregon Green 488 azide посредством катализируемой медью ковалентной реакции.

Заключительным этапом процедуры является усиление сигнала Orgon Green с помощью этапа усиления сигнала арамидом для визуализации EDU, которая была встроена в синтезированную заново мтДНК. В конечном итоге можно получить результаты, демонстрирующие репликацию мтДНК в конкретных субклеточных компартментах нейронов благодаря сочетанию клик-химии EDU и последующего усиления сигнала tear mind. Основным преимуществом данного метода перед существующими способами, такими как маркировка BrDU, является то, что маркировка EDU проходит проще и в более мягких условиях, что позволяет проводить дополнительное иммунофлуоресцентное окрашивание нейрональных маркеров.

Этот метод позволяет ответить на ключевые вопросы о регуляции количества митохондрий, например, о том, как нейроны справляются с меняющейся энергетической нагрузкой в своих субклеточных компартментах, включая тела клеток, аксоны, дендриты и синаптические терминали. Таким образом, данный метод может дать представление о механизмах, лежащих в основе патогенеза различных митохондриальных неврологических заболеваний, включая нейропатии и нейродегенерацию. Важно отметить, что он также может быть применен к другим системам, в которых изменения числа копий митохондриальной ДНК, вероятно, лежат в основе патогенеза патологического состояния, включая токсичность лекарственных средств, рак и старение.

В данном видео демонстрируется способ маркировки недавно синтезированной митохондриальной ДНК (сокращенно M-T-D-N-A) в нейронах спинномозговых ганглиев, выращенных на стерильных стеклянных покровных стеклах диаметром 12 миллиметров. В 24-луночной культуральной планшете разведите 10 миллимолярный стоковый раствор 5-этнонил-2'-дезоксиуридина (сокращенно EDU) из набора Clicka EDO Microplate assay kit в соотношении 1:100 в культуральной среде для получения 10-кратного стокового раствора EDU. Затем добавьте 10-кратный стоковый раствор EDU непосредственно в среду в каждую лунку. Инкубируйте обработанные нейроны от 2 до 24 часов при 37 °C и 5% carbon dioxide в вытяжном шкафу.

Фиксируйте нейроны в 2% параформальдегиде в течение 10–15 минут при комнатной температуре. Промойте дважды в 1x PBS, по две-пять минут на каждую промывку. Фиксированные нейроны можно хранить в свежем 1x PBS при температуре 4 °C до одного месяца.

Подготовьте влажную камеру согласно описанию в сопроводительном тексте. С помощью тонких пинцетов перенесите 28 зафиксированных покровных стекол, включая положительные и отрицательные контроли EDU, на листы гидрофобного параформа M внутри влажной камеры. Снова нанесите 200–300 µL раствора 1×PBS, чтобы покрыть поверхность каждого покровного стекла.

Подготовьте набор для анализа Click-iT согласно описанию в тексте и инструкциям производителя; для маркировки митохондриальной ДНК нанесите 75–80 µL проникающего раствора, содержащего 0,1% Triton X-100 в 1×PBS, на каждое покровное стекло и инкубируйте при комнатной температуре в течение 10 минут. Используйте бульбочную переносную пипетку с закрепленным на конце наконечником на 200 µL, чтобы осторожно удалить жидкость, не теряя клеток.

С помощью бульбочной пипетки осторожно залейте покровное стекло. Добавьте от 200 до 300 µL 1XPBS, чтобы тщательно вымыть предыдущий раствор. Промойте каждое покровное стекло дважды.

Пипетируйте от 75 до 80 µL свежего 1% перекиси водорода в 1X PBS на каждое покровное стекло. Инкубируйте в закрытом виде в течение 30 минут при комнатной температуре для гашения эндогенной пероксидазной активности. Промойте дважды 1X PBS, как указано ранее, затем приготовьте свежий коктейль для клик-реакции согласно описанию в сопроводительном тексте.

Смешайте содержимое, осторожно перенося жидкость пипеткой вверх и вниз. Не используйте вортекс. Последующую фиксацию нейронов проведите, добавив от 75 до 80 µL фиксатора Click-iT EDU на каждое покровное стекло; инкубируйте при комнатной температуре в течение пяти минут. Во время инкубации при последующей фиксации разбавьте реакционный коктейль равным объемом фиксатора Click-iT EDU.

Добавьте реакционную смесь на каждое покровное стекло, защитите от света и инкубируйте при комнатной температуре в течение 25 минут. Осторожно удалите реакционную смесь и дважды промойте 1х разведенным блокирующим буфером под эпифлуоресцентным микроскопом. После завершения окрашивания EDU проверьте наличие окрашивания ядер Organ Green.

Начните процедуру усиления сигнала терминальной деоксинуклеотидилтрансферазой (TSA): добавьте в каждое покровное стекло блок-раствор TSA 1% и инкубируйте при комнатной температуре в течение 30 минут. Кратковременно центрифугируйте сток антител, конъюгированных с пероксидазой хрена анти-🟢, подготовленный за 2–24 часа до проведения TSA. Разведите первичные антитела в блок-растворе TSA в соотношении 1:300, перемешав путем переворачивания пробирки или с помощью пипетки, не используя вортекс. Добавьте по 75 µL на каждое покровное стекло и инкубируйте при 4 °C в течение ночи.

На следующий день трижды промойте образцы раствором XPBS при комнатной температуре. Инкубируйте покровные стекла в финальном промывочном растворе еще в течение 30–60 минут, чтобы обеспечить удаление несвязавшихся первичных антител. Непосредственно перед использованием подготовьте реакционную смесь для IDE в соответствии с текстовой частью данного протокола.

Инкубируйте покровные стекла с реакционной смесью IDE в течение 15 минут при комнатной температуре. Промойте трижды XPBS, выдержав при последней промывке от 30 до 60 минут, как описано ранее, под микроскопом. Проверьте наличие маркировки мтДНК; зафиксируйте успешно окрашенные нейроны на предметных стеклах, используя среду для заключения ANTIFA, содержащую DPI. Здесь представлены репрезентативные изображения нейронов ганглиев задних корешков эмбрионов и взрослых животных, полученные с помощью дифференциально-интерференционного контраста, которые обычно используются для анализа.

На этих схемах представлена процедура мечения EDU в МТД НА зеленым флуоресцентным сигналом. Митотически активные клетки нейробластомы F 11 служат положительным контролем и иллюстрируют характер мечения EDU, который был включен в ядерную и митохондриальную ДНК на этих репрезентативных изображениях флуоресценции, наложенных на изображение в светлом поле. Зеленые точечные сигналы демонстрируют усиленный сигнал EDU, включенный в новосинтезированную M-D-D-N-A нейронов дорсальных корешков спинного мозга как эмбрионального, так и взрослого периода.

Процедура маркировки EDU позволяет в дальнейшем провести иммунофлуоресцентное окрашивание нейрональных маркеров, таких как нейрофиламент, красным цветом. На данных схемах представлена процедура маркировки EDU и MTD NA красным флуоресцентным сигналом. Митотически активные клетки нейробластомы F 11 служат положительным контролем и демонстрируют характер маркировки EDU, встроившегося в ядерную и митохондриальную ДНК.

На данной схеме представлена процедура маркировки BRDU в новосинтезированной мтДНК с использованием зеленого или красного флуоресцентного сигнала. При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости проведения контрольных экспериментов с использованием митотически активных клеток для проверки успешности маркировки EDU и визуализации ядер клеток перед переходом к этапам амплификации для визуализации маркировки мтДНК согласно данному протоколу. Для ответа на дополнительные вопросы, например, о том, как регулируется синтез митохондриальной ДНК в конкретных субпопуляциях нейронов или отделах нейронов, могут быть применены другие методы, такие как стандартная иммунофлуоресценция. Благодаря разработке данного метода исследователи в области нейробиологии смогут изучать регуляцию количества митохондрий как в культуральных моделях нормальной физиологии, так и в моделях, имитирующих патологические состояния.

Неврологические состояния.