Подготовка Мышь гипофиза Иммуноген для индукции экспериментального аутоиммунного гипофизит

Аутоиммунный гипофизит характеризуется увеличением гипофиза и дефицитом одного или нескольких гормонов гипофиза. Причинные аутоантигены остаются неизвестными. В данной работе представлен протокол подготовки белков гипофиза мыши для использования в изучении этого заболевания.

Сначала из эвтаназированных мышей изолируют гипофизы. Затем гипофизы гомогенизируют для механического разрушения клеток и высвобождения цитозольных белков. Гомогенат очищают путем центрифугирования при низкой скорости, после чего определяют количество белка с помощью колориметрического метода BCA, а качество — с помощью полиакриламидного гель-электрофореза.

Наконец, водный гомогенат белка смешивают с масляным адъювантом. Полученную смесь затем вводят мышам для создания мышиной модели, имитирующей аутоиммунный гипофизит. Как показано в сопроводительном видео, для индукции гипофизита у экспериментальных животных было описано четыре метода.

Метод, представленный в данной статье и заключающийся в инъекции смеси белков гипофиза в качестве адъюванта гриппа, является старейшим и восходит к 1960-м годам. Другие подходы включали инъекции растворимых гликопротеинов вируса краснухи в 1992 году, стереотаксическую инъекцию аденовируса непосредственно в гипофиз в 2002 году и трансплантацию гипофиза одной линии крыс под капсулу почки крысы другой линии в 2010 году. Главным преимуществом метода с использованием адъюванта по Флоренс является то, что в настоящее время он менее инвазивен, более стабилен и, прежде всего, более точно индуцирует заболевание, которое максимально близко к человеческому аналогу.

Несмотря на то, что методика применения чужеродного адъюванта описывалась еще с 1960-х годов, она была малоэффективна для индукции гипофизита. В начале моей работы над докторской диссертацией, используя опубликованный протокол с чужеродным адъювантом, мне удавалось добиться лишь умеренной частоты возникновения и степени тяжести гипофизита. Ситуация значительно улучшилась, когда мне пришла в голову идея десятикратно увеличить количество белков гипофиза в эмульсии.

Хотя эти методы могут дать представление о патогенезе аутоиммунного гипофизита, они также могут быть использованы для изучения других аутоиммунных заболеваний, аутоантигены которых еще предстоит идентифицировать. Как правило, специалисты, впервые применяющие эти методы, сталкиваются с наибольшими трудностями на последнем этапе — подготовке эмульсии, так как это требует определенных мануальных навыков, времени и усердия. Поэтому визуальная демонстрация имеет решающее значение для понимания того, как правильно подготовить эмульсию.

Значимость данной методики выходит за рамки области аутоиммунитета. Знание того, как подготовить антиген для иммунизации, может быть также использовано при производстве моноклональных антител или при тестировании новых вакцин. Данную методику продемонстрируют S Zoo heroic Ura и Mayland al gato из моей лаборатории.

Гипофиз мыши представляет собой железу цилиндрической формы, расположенную в основании черепа в углублении клиновидной кости, называемом турецким седлом. Железа ограничена латерально тройничными нервами, а спереди — хиазмой зрительных нервов. Она состоит из более крупной передней доли, а также меньших по размеру промежуточной и задней долей.

Для выделения гипофиза с помощью ножниц обезглавьте эвтаназированную мышь, затем сделайте параллельные разрезы от затылка к передней части черепа. Приподнимите мозг и отклоните его назад, чтобы обнажить гипофиз, который выглядит как цилиндр в основании равнобедренного треугольника, где гипофиз служит основанием, тройничные нервы — сторонами, а зрительный перекрест — вершиной.

Обведите железу кончиками закрытого пинцета, чтобы разорвать окружающую оболочку. Затем с помощью тонкого пинцета извлеките гипофиз из турецкого седла и поместите его в пластиковую пробирку на сухой лед. Для одной пробы соберите 300 гипофизов мыши.

Этот сбор занимает примерно девять человеко-часов. После завершения сбора храните гипофизы при температуре -80 °C до их использования. Поместите пробирку Falcon объемом 15 мл в ледяную баню.

Добавьте в пробирку 250 µL буфера для гомогенизации. На каждые 100 гипофизов, собранных непосредственно перед гомогенизацией, перенесите гипофизы мышей в буфер. Затем поместите наконечник гомогенизатора Polytron с генератором диаметром 5 мм на дно пробирки Falcon, содержащей гипофизы мышей и буфер, и проводите гомогенизацию на максимальной скорости в течение 30 секунд.

Осторожно перемещайте пробирку вверх и вниз, удерживая её на льду. Затем выдержите гомогенат на льду в течение одной минуты. Повторите этапы гомогенизации и охлаждения еще дважды.

Такая бережная гомогенизация должна привести к разрушению клеток и высвобождению белков, не повреждая при этом ядра. Центрифугируйте гомогенат на низкой скорости, примерно 1000 G в течение 10 минут при температуре четыре градуса Цельсия, чтобы осадить ядра, неразрушенные ткани и нерастворимые материалы, такие как соединительная ткань и комплексы денатурированных белков. Старайтесь не потревожить осадок.

Перенесите супернатант, который теперь называется постъядерной фракцией (PNS), в новую пробирку Falcon для хранения. Удерживая PNS на льду, ресуспендируйте осадок тем же объемом гомогенизационного буфера, что и ранее, затем повторите этапы гомогенизации и центрифугирования. Объединив два образца PNS, разлейте раствор по нескольким микроцентрифужным пробиркам.

Храните микроцентрифужные пробирки при температуре -80 °C до использования. Данный препарат белка стабилен при -80 °C, однако его активность постепенно снижается. Поэтому рекомендуется использовать его в течение шести месяцев после приготовления.

Оставьте одну небольшую аликвоту PNS для определения выхода и концентрации белка с помощью метода с бицининовой кислотой. Затем определите качество белка с помощью гель-электрофореза, используя 300 гипофизов мышей, средний общий вес которых составляет примерно 570 milligrams. Ожидаемый выход составляет 60 milligrams белков гипофиза или one milligram белка на каждые 10 milligrams ткани.

Концентрация белка обычно составляет около 40 mg/mL. Приведенный здесь пример рассчитан на иммунизацию 10 мышей. При планировании в каждую мышь вводят 100 µL эмульсии, содержащей 1 mg гипофизарного белка; с учетом двух дополнительных мышей для компенсации потерь материала при подготовке, здесь готовится 12 mg белковой эмульсии.

Начните с быстрого размораживания замороженных аликвот белка, согревая их в руках. Доведите концентрацию белка до 20 mg/mL с помощью PBS. Затем наберите в шприц Gas Tite Hamilton объемом 2,5 mL 600 µL экстракта белка гипофиза, соответствующего 12 mg, и ресуспендируйте его в complete FRONS адъюванте или CFA, содержащем 5 mg/mL термоинактивированного Mycobacterium tuberculosis, путем ручного встряхивания.

Затем наберите 600 µL CFA в другой шприц Hamilton объемом 2,5 мл. Присоедините и зафиксируйте микроэмульгирующую иглу калибра 22 G к шприцу, заполненному CFA. Медленно нажмите на поршень так, чтобы игла заполнилась CFA.

Затем подсоедините и закрепите другой конец иглы к другому шприцу, заполненному экстрактом белков гипофиза. Избегайте попадания пузырьков воздуха в шприцы. Медленно нажмите на поршень шприца с CFA, чтобы ввести масляный компонент в водный экстракт гипофиза так, чтобы смешалось лишь небольшое количество.

Затем нажмите на поршень шприца с экстрактом гипофиза, перемещая его содержимое в шприц с CFA. Повторяйте это действие, постепенно увеличивая объем смешиваемого материала, до полного смешивания всего содержимого. Эта беловатая однородная масса представляет собой водно-масляную эмульсию.

После образования эмульсии повторите полный цикл перемещения поршней туда и обратно не менее 500 раз; после завершения последнего цикла в шприцах будет находиться эмульсия воды и масла в соотношении один к одному с концентрацией гипофизарного белка 10 mg/mL. Эмульсия готова к использованию. Чтобы проверить качество эмульсии, добавьте одну её каплю в стакан с водой. При правильном приготовлении эмульсии капля останется компактной и плотной на поверхности.

Если эмульсия низкого качества, она будет растекаться и распадаться на более мелкие капли. Эмульсию вводят мышам линии SJL в тот же день после ее приготовления для индукции экспериментального аутоиммунного гипофизита. Данный протокол подробно описан в сопутствующем видео JoVE.

После того как гипофиз был собран, а техника освоена, процедуру выделения белка можно выполнить за один час, помня о необходимости работать быстро и на льду. Этот этап, подготовка иммерсии, занимает примерно один час. Помните, что на начальной фазе смешивания после ее подготовки следует работать медленно и терпеливо.

Этот метод открыл исследователям в области аутоиммунитета путь к изучению механизмов, с помощью которых аутореактивные лимфоциты распознают орган-мишень и инфильтрируют его. После просмотра данного видео вы должны будете четко понимать, как подготовить белковый экстракт из гипофиза мыши и как смешать его с адъювантом Фрейнда для приготовления эмульсии, готовой к использованию в качестве иммуногена. Не забывайте, что работа со шприцами и полным адъювантом Фрейнда, который содержит инактивированные и высушенные микробактерии туберкулеза, может быть опасна в случае случайного прокола кожи.

Поэтому при выполнении данной процедуры всегда используйте перчатки и утилизируйте иглы надлежащим образом.