В естественных условиях Количественная оценка G белком рецептор взаимодействий с использованием спектрально Решено Двухфотонное микроскопии

Общая цель следующего эксперимента заключается в определении стехиометрической и структурной информации о белке. Все лигандные комплексы, экспрессируемые в живых биологических клетках (дрожжевых клетках), генетически модифицированы для экспрессии интересующих белков, присоединенных либо к донорному, либо к акцепторному флуоресцентному зонду. Донорные зонды могут возбуждаться лазером напрямую.

В то время как акцепторы могут быть возбуждены только посредством переноса энергии от находящегося рядом возбужденного донора, клетки подвергаются воздействию света импульсного ближнего инфракрасного лазера. Флуоресценция, исходящая от зондов, разделяется на спектральные компоненты с помощью дифракционной решетки и проецируется на поверхность матрицы с электронно-умножающим ПЗС-сенсором. Таким образом, для каждой позиции в образце получаются полные флуоресцентные спектры отдельных лигаментов.

Спектральный профиль детектируемой флуоресценции зависит от специфического взаимодействия исследуемых белков. Данные анализируются для того, чтобы для каждого пикселя изображения сканируемой ячейки определить раздельные сигналы испускания донорных и акцепторных зондов. Эффективность переноса энергии определяется для каждого пикселя изображения, после чего пиксели группируются в зависимости от их эффективности FRET и гистограммы.

Интерпретация гистограммы позволяет определять размер и конфигурацию белка или комплекса in vivo. Здравствуйте, меня зовут Майкл Стоунмен, я представляю исследовательскую группу Рику из Университета Висконсина в Милуоки. Меня зовут Сингх.

Я из лаборатории Рикуса в Милуоки, штат Висконсин. Основное преимущество данного метода заключается в том, что полные профили эмиссии сотен всех лигаментных комплексов внутри клетки получаются за одно полное сканирование клетки. Как правило, большинство методов флуоресцентной микроскопии требуют многократного сканирования исследуемой клетки для накопления достаточного объема спектральной информации, чтобы определить эффективность FRET в различных областях интереса внутри клетки.

Однако биохимические диффузионные реакции могут изменять молекулярный состав этих областей интереса и тем самым ограничивать объем информации, получаемой при сканировании изображения. Данный метод может помочь ответить на ключевые вопросы при изучении белков и белковых взаимодействий в живых клетках, такие как: каков размер вредоносных олигомеров? На каком этапе жизненного цикла белка формируются олигомеры и какова роль олигомеров данного белка в функционировании клетки?

Спектрально-разрешающий двухфотонный микроскоп накапливает спектральную информацию о комплексах олима в исследуемой клетке путем сканирования фокуса возбуждающего пучка в нескольких точках образца. Пара ортогональных сканирующих зеркал используется для перемещения фокуса лазерного луча по образцу в двух разных направлениях. Движение сканирующих зеркал контролируется компьютером и синхронизируется с извлечением данных об интенсивности флуоресценции с ПЗС-камеры; на основе линейного сканирования можно реконструировать пространственные карты интенсивности флуоресценции, соответствующие определенной длине волны света.

Для точной реконструкции пространственных карт интенсивности рентгеновской флуоресценции и расчета фактической длины волны, соответствующей каждой из этих карт, протокол линейного сканирования необходимо откалибровать с использованием раствора флуоресцеина. Чтобы начать процедуру калибровки, установите спектр возбуждения на длину волны 800 нанометров, что в два раза превышает максимальную длину волны возбуждения донорного тега GFP 2-2. Чтобы настроить спектр возбуждения, переместите призму, расположенную внутри лазерного резонатора, для изменения дисперсии групповой скорости с помощью компьютерной программы, с которой сопряжена камера. Отправьте команду на чип ПЗС для снижения температуры чипа ПЗС до минимально достижимого значения.

Для снижения уровня темнового шума пипеткой нанесите 10 µL раствора флуоресцеина на предметное стекло микроскопа и накройте его покровным стеклом таким образом, чтобы тонкий слой образца был равномерно распределен в пространстве между покровным и предметным стеклами; на поверхность покровного стекла нанесите небольшую каплю иммерсионного масла. Затем закрепите предметное стекло в предметном столике с XY, Z-перемещением и переместите стекло и столик вдоль оптической оси. Вручную регулируя линейный актуатор, перемещайте стекло до тех пор, пока объектив микроскопа не коснется капли иммерсионного масла; переведите камеру в режим видеозахвата данных, чтобы свет, попадающий на ПЗС-матрицу, отображался на экране компьютера в режиме реального времени.

Выключите весь комнатный свет, чтобы снизить уровень фонового шума, регистрируемого ПЗС-матрицей. Медленно поворачивайте микрометр, управляющий перемещением предметного столика вдоль оптической оси, чтобы ввести образец в фокальное пятно лазерного луча. Когда образец флуоресцеина окажется в фокусе, эмиссия будет выглядеть как четкая линия на ПЗС-матрице.

Загрузите данные об интенсивности пикселей с ПЗС-матрицы на компьютер. Измерьте интенсивность пикселей в зависимости от положения на ПЗС-матрице, открыв загруженную матрицу значений интенсивности в программе ImageJ и проведя линию через флуоресцентную область. Используйте команду ImageJ.

Проанализируйте профиль графика, чтобы создать график, иллюстрирующий спектр эмиссии образца флуоресцеина. Отрегулируйте параметр приращения зеркала, который управляет перемещением лазера. Сфокусируйтесь по направлению Y таким образом, чтобы соседние положения по оси y внутри образца приводили к смещению пика флуоресцентных спектров ровно на один пиксель вдоль спектрального измерения на ПЗС-матрице.

Для мониторинга этого процесса загрузите интенсивность спектров флуоресцеина для двух различных положений Y в образце. Затем откройте изображения интенсивности в программе ImageJ и определите положение пикселя с максимальной интенсивностью для каждого из флуоресцентных спектров. С помощью курсора ImageJ, оставив затвор ПЗС-матрицы открытым, просканируйте фокусировку лазера по образцу в направлении X.

Свет, излучаемый каждым вокселем вдоль линии сканирования, должен падать на ПЗС-матрицу в конце каждого линейного сканирования; после этого данные с ПЗС-матрицы, полученные за данное сканирование, сохраняются, а пиксели матрицы очищаются. Измените положение лазера. Выполните фокусировку по оси Y на величину, определенную ранее.

Затем перемещайте лазерный луч в направлении X поперек образца. Снова, оставив затвор ПЗС-матрицы открытым, сохраните данные. Повторяйте эту процедуру линейного сканирования до тех пор, пока лазерным светом не будет освещена область, примерно на 50% превышающая размеры одной биологической клетки.

Для реконструкции изображений и получения нескольких карт интенсивности флуоресцентного возбуждения на разных длинах волн следует использовать соотношение между номером строки конкретного изображения линейного сканирования и длиной волны. Чтобы получить изображение флуоресцентного излучения для определенной длины волны, найдите номер строки на изображении, полученном при первом линейном сканировании, которая соответствует этой длине волны. Затем следующая соседняя строка на изображении последующего линейного сканирования будет соответствовать следующей строке изображения флуоресцентного излучения.

Для данной конкретной комбинации длин волн объедините все строки изображений, соответствующие этой длине волны, чтобы получить пространственные карты XY интенсивности флуоресценции образца на этой длине волны. Повторите эту процедуру для всех остальных доступных длин волн, чтобы собрать данные по вашим образцам. Сначала извлеките из инкубатора планшеты с колониями трансформированных дрожжей.

Должно быть не менее трех типов трансформированных клеток: клетки, экспрессирующие исследуемые белки, меченные обоими типами флуоресцентных зондов; клетки, экспрессирующие только белки с донорными флуоресцентными зондами; и клетки, экспрессирующие только белки с акцепторными флуоресцентными зондами.

Добавьте 100 µL 100 мМ хлорида калия в микроцентрифужную пробирку. Затем с помощью наконечника микропипетки соберите три-пять колоний дрожжей с чашки с клетками, экспрессирующими белки, меченные как донорским, так и акцепторским флуоресцентными зондами, и инокулируйте их в 100 мМ хлорид калия. Из полученной клеточной суспензии отберите 10 µL и нанесите их на чистое предметное стекло микроскопа.

Накройте каплю покровным стеклом и поместите каплю масла на поверхность покровного стекла. Затем вручную закройте заслонку на пути лазерного луча, чтобы предотвратить попадание лазерного излучения в объектив микроскопа. Закрепите предметное стекло в переводнике по осям XY и Z и перемещайте столик в направлении оптической оси до тех пор, пока объектив микроскопа не коснется капли иммерсионного масла.

Теперь включите широкопольное освещение и перейдите к настройкам камеры. Выберите режим видеозаписи для сбора данных. Широкопольное изображение образца будет сильно размыто из-за наличия дифракционной решетки в канале эмиссии.

Следовательно, поместите в оптический путь перед дифракционной решеткой полосовой фильтр с малой шириной на полувысоте. Медленно перемещайте предметный столик вдоль оптической оси, наблюдая за изображением клеток на экране камеры, пока клетки не окажутся в фокусе. Переместите столик по оси X или Y, чтобы совместить отдельную клетку с точкой фокусировки лазерного луча.

Выключите источник широкопольного освещения и извлеките полосовой фильтр из пути эмиссии. На короткое время откройте затвор лазерного луча, одновременно наблюдая за сигналом, поступающим на ПЗС-матрицу. Если в момент воздействия лазерного луча на клетку на ПЗС-матрице регистрируется флуоресцентный сигнал, выполните полный цикл сбора флуоресцентных данных для этой клетки.

Крайне важно использовать те же параметры сканирования, а именно количество линий и шаг Y, которые были определены в ранее продемонстрированной процедуре калибровки. Повторите процесс определения местоположения клеток и сбора данных флуоресценции для большого количества клеток, экспрессирующих белок, связанный как с донорными, так и с акцепторными метками. После накопления достаточного количества флуоресцентных изображений клеток, экспрессирующих белки с обоими рецепторами, повторите весь процесс сначала для клеток, экспрессирующих только белки с донорными флуоресцентными зондами, а затем для клеток, экспрессирующих только белки с акцепторными флуоресцентными зондами.

Наконец, реконструируйте все сканы, чтобы получить спектрально разрешенные пространственные XY-карты интенсивности флуоресценции для каждого набора данных, используя описанную ранее процедуру. На этих трех рисунках представлены результирующие пространственные карты, рассчитанные на основе спектрально разрешенных измерений двухфотонной микроскопии, проведенных на клетке дрожжей, экспрессирующей рецептор стерол-альфа-фактора. Двумерные карты сигналов донора и акцептора были получены путем анализа профилей спектрального излучения, зарегистрированных в каждой точке клетки.

Интенсивности флуоресценции обозначены ложными цветами в соответствии с их значениями; шкала представлена во врезке. Затем была вычислена двумерная карта кажущейся эффективности FRET с использованием изображений KDA и KAD и значений, извлеченных из карты кажущейся эффективности FRET только что показанной клетки; также была построена гистограмма. Измеренные значения EAPP клетки представлены кружками.

Красная сплошная линия представляет собой наилучшее приближение к измеренным данным, полученное с использованием суммы отдельных функций кальция, обозначенных сплошными зелеными линиями. Анализ гистограммы, описание которой приведено в тексте протокола, подтверждает, что стерильный комплекс лиганда с рецептором фактора альфа в живом организме принимает форму тетрамера типа RBA. После освоения метода его выполнение занимает 12 часов при условии правильного соблюдения всех этапов.

При проведении этого эксперимента важно поддерживать низкую мощность источника возбуждения. Необходимо избегать многократного возбуждения донора одним импульсом.