Количественная Синапсы: Иммуноцитохимическая основе Пробирной количественно Synapse Количество

Одной из важнейших задач нейробиологии является понимание молекулярных сигналов, которые определяют ранние этапы формирования синапсов. В связи с этим крайне важным стало создание объективных подходов для количественной оценки изменений синаптической связности. Для количественного определения числа синапсов в различных экспериментальных препаратах культивируемые нейроны или криосрезы тканей мозга окрашивают селективными пре- и постсинаптическими маркерами для маркировки точек синаптического контакта между нейронами.

Затем клетки или ткань визуализируют на флуоресцентном микроскопе, получая 8-битные изображения для каждого из каналов, соответствующих двум иммуногистохимическим маркерам. Изображения анализируют в программе Image J 1.29 с использованием плагина Puncta Analyzer. Для определения степени колокализации пресинаптических и постсинаптических маркеров точки колокализации используют для подсчета количества синапсов в препарате.

Основным преимуществом описанного здесь метода по сравнению с существующими подходами, такими как электронная микроскопия, является то, что данный анализ синапсов позволяет проводить количественную оценку и высокопроизводительный анализ количества синапсов. Основная значимость этой методики заключается в возможности ее применения для диагностики и терапии клинических расстройств, таких как болезнь Альцгеймера, эпилепсия или аутизм, при которых нарушения синаптической связности рассматриваются как основа лежащей в их основе патологии. Данный метод может быть использован для поиска способов вмешательства, способных уменьшить или исправить недостатки в способности пораженных нейронов формировать синапсы друг с другом.

Хотя данный метод полезен для изучения развития мозга, он также может быть применен к другим модельным организмам или органным системам, в которых необходимо изучить или количественно оценить число межклеточных контактов, при условии возможности селективного мечения каждой противоположной стороны каждого участка контакта. Подготовьте нейрональные культуры, высеяв очищенные ганглионарные клетки сетчатки крысы, полученные от животных в возрасте P5–P7, на стеклянные покровные стекла, покрытые поли-D-лизином. В 24-луночном планшете клеткам дают расти при 37 °C в течение трех-пяти дней до проведения трансфекции.

После трансфекции инкубируйте клетки еще семь-восемь дней до тех пор, пока высеянные клетки не достигнут достаточной зрелости для формирования синапсов. Удалите культуральную среду из лунок и добавьте в каждую лунку 500 µL предварительно подогретого 4% параформальдегида для фиксации в течение семи минут. После фиксации при комнатной температуре трижды промойте клетки фосфатно-солевым буферным раствором.

Важно следить за тем, чтобы клетки в лунках не пересыхали. После удаления буфера из лунки его следует незамедлительно заменить следующим буфером. Приготовьте блокирующий буфер, содержащий 50% нормальной сыворотки козы и 0,2% Triton X 100.

После удаления PBS из каждой лунки добавьте в каждую по 200 microliters блокирующего буфера и инкубируйте для блокировки в течение 30 минут при комнатной температуре. Затем удалите блокирующий буфер и промойте лунки трижды. Используя PBS, приготовьте разведение первичных антител в растворе, состоящем из 90% буфера для антител и 10% NGS, содержащем выбранную пару пре- и постсинаптических антител.

Здесь используются кроличьи антитела к синапсину (пресинаптический маркер) и мышиные антитела к Homer (постсинаптический маркер). Центрифугируйте раствор первичных антител в течение пяти минут на максимальной скорости в настольной центрифуге для удаления любых осажденных антител, затем добавьте по 200 microliters раствора первичных антител в каждую лунку. Поместите планшет во влажный контейнер, чтобы предотвратить высыхание первичного раствора.

После инкубации с первичными антителами выдержите образцы в течение ночи при температуре 4 °C. Промойте каждую лунку три раза. С помощью PBS добавьте 200 µL соответствующих вторичных антител, разведенных 1:1000 в приготовленном буфере для антител, содержащем 10% NGS.

Как и прежде, поместите чашку в увлажненную камеру и инкубируйте в течение двух часов при комнатной температуре в темноте после инкубации со вторичными антителами. Промойте каждую лунку три-четыре раза PBS. Нанесите каплю закрепляющей среды Vector Shield с DPI на предметное стекло.

Затем переверните покровное стекло с клетками на каплю для фиксации. В завершение нанесите бесцветный лак для ногтей по краям покровного стекла. Будьте осторожны, чтобы не сдвинуть и не сместить покровные стекла во время нанесения.

Поскольку это приведет к повреждению клеток, дайте предметным стеклам высохнуть в течение не менее 30 минут в сухом темном месте. Визуализация проводится с использованием флуоресцентного микроскопа ZEISS Axio Imager, оснащенного соответствующими наборами фильтров и масляным иммерсионным объективом с увеличением 63 раза. Поместите на предметный столик микроскопа стекло с нетрансфецированными клетками.

Используя набор фильтров DPI для визуализации ядер клеток, выберите клетки, которые находятся на расстоянии не менее двух клеточных диаметров от своих ближайших соседей. Использование DPI на данном этапе поможет избежать систематической ошибки и обеспечит случайность выбора клеток. Для каждой выбранной клетки получите 8-битные изображения, используя соответствующие наборы фильтров, в данном случае — GFP и Texas Red.

На наложенном псевдоцветном изображении должны быть видны пресинаптические и постсинаптические маркеры, окрашенные в красный и зеленый цвета соответственно. Затем поместите на предметный столик микроскопа образец с трансфицированными клетками. В данном случае клетки были трансфицированы экспрессионным вектором TD tomato.

Используйте этот маркер для выбора клеток, как и раньше. Для каждой выбранной клетки получите восемь изображений синаптических ямок, используя соответствующие наборы фильтров, в данном случае: GFP, Texas Red и Sci five. На совмещенном псевдоцветном изображении постсинаптические маркеры должны быть окрашены в красный, зеленый и синий цвета.

В данном случае программа анализа пунктат используется для количественного определения колокализованных синаптических пунктат. Плагин Puncta analyzer был написан Бэрри Уоком и доступен по запросу в ImageJ 1.26. Откройте одно из полученных изображений.

Используйте инструмент кругового выделения, чтобы выбрать область радиусом примерно в один диаметр клетки вокруг интересующего SOR. После выделения интересующей области перейдите в меню плагинов (plugins) и выберите puncture analyzer; в появившемся окне параметров анализа выберите Red Channel и Green Channel. Сначала выполните вычитание фона (subtract background) и укажите файл для сохранения результатов.

Нажмите «ОК». Затем укажите папку для сохранения результатов. В появившемся окне эти результаты можно экспортировать в Excel для дальнейшего анализа.

Затем убедитесь, что выбран радиус скатывающегося шара (rolling ball radius), равный 50, и снимите флажок с опции белого фона. Данная модификация не является обязательной, но часто предпочтительна для пользователей приложения. Для облегчения визуализации нажмите ОК.

Рядом появится новое окно с маской, соответствующей изображению красного канала. Отрегулируйте порог так, чтобы красная маска максимально точно соответствовала возможному количеству отдельных проколов. Нажмите «готово», стараясь не допустить появления избыточного шума.

Установите минимальный размер пунктов на четыре пикселя. Больше ничего не изменяйте. Нажмите «ОК».

Повторите предыдущий этап, на этот раз для зеленого канала. После выполнения этой процедуры для зеленого канала плагин предоставит данные количественного анализа пунктат каждого канала в отдельности, а также количество совместно локализованных пунктат в обоих каналах. Описанный здесь метод анализа синапсов может быть применен к криосрезам головного мозга, а также к любым другим тканям нервной системы, таким как спинной мозг или сетчатка.

При наличии подходящей пары пре- и постсинаптических маркеров начните с забора тканей головного мозга мыши, подвергнутой эвтаназии путем обескровливания и перфузии раствором PBS. Поместите весь мозг в 4% раствор паральдегида в PBS при температуре четырех градусов Цельсия на ночь, чтобы приступить к работе на следующий день.

Промойте мозг трижды в PBS. Проведите криопротекцию мозга, поместив его в 30% sucrose в PBS.

Ткань первоначально будет плавать; ее следует выдерживать при температуре 4 °C до тех пор, пока она не осядет на дно. На этом этапе криопротекция завершена. Затем в растворе из 20% сахарозы, OCT и PBS в соотношении 2:1 залейте мозг в среду в нужном для последующего секционирования положении.

Например, сагиттальный или корональный. Затем поместите плоскую металлическую поверхность на емкость с сухим льдом. Поместите на нее имбедированный мозг для замораживания; после замораживания перенесите мозг в пакет для заморозки и храните при температуре -80 °C до одного года перед проведением секционирования.

С помощью криостата выполните криосекции ткани толщиной от 12 до 16 микрон и закрепите их на предметных стеклах. Затем высушите стекла, поместив их в термостат при температуре 37 °C. После этого трижды промойте их PBS для удаления остатков OCT.

Парафиновым маркером создают гидрофобный барьер по периметру предметного стекла, после чего на стекло наносят блокирующий буфер, который удерживается внутри созданной парафиновой границы. Для блокирования поместите стекла в 20% нормальную сыворотку козы в PBS на один час при комнатной температуре. Затем перенесите срезы в раствор первичных антител, разведенных в PBS с 0,3% Triton и 10% нормальной сывороткой козы.

Здесь кроличьи антитела к PSD 95 используются для маркировки глутаматергических постсинаптических компартментов, а антитела морской свинки к vGlu2 — для маркировки глутаматергических пресинаптических терминалей. Поместите предметные стекла при температуре 4 °C и инкубируйте от 36 до 60 часов. После инкубации удалите первичные антитела, трижды погрузив стекла в PBS на 15 минут каждое.

После этого этапа убедитесь, что предметные стекла защищены от прямого света. Нанесите вторичные антитела, разведенные 1:200 в PBS с 0,3% Triton и 10% нормальной сыворотки козы. В данном случае используются козьи антитела против антигенов морских свинок.

Используют Alexa 488 и козьи антитела против кроличьих, а также Alexa 594. Инкубируют в течение двух часов при комнатной температуре в темноте.

Промойте стекла, четырежды погружая их в PBS на 15 минут каждое, перед заключанием препаратов. С помощью аппликатора нанесите небольшие капли среды для заключения Vector Shield и накройте стекла покровными стеклами. Нанесите лак для ногтей, чтобы зафиксировать покровные стекла и предотвратить их смещение.

Визуализацию срезов ткани следует проводить с помощью конфокального микроскопа с соответствующими лазерами, используя иммерсионный объектив с увеличением 63x для каждого изображения среза; при этом необходимо выполнять серийные оптические срезы с интервалом 0,33 micron на общую глубину пять micron, что в сумме дает 15 оптических срезов. Для каждого экспериментального условия необходимо визуализировать не менее трех срезов от каждого животного и включить в исследование не менее трех животных. На основе групп из трех последовательных срезов следует создать проекции максимальной интенсивности, в результате чего будут получены пять проекций, каждая из которых соответствует глубине в один micron.

Количественный анализ проводили с помощью программы Image J, как описано для RG Cs, используя модифицированную область интереса (ROI) для определения количества синапсов, сформировавшихся в отсутствие астроцитов. Иммунохимическое окрашивание диссоциированных rgc, культивируемых в базовой среде для роста, проводили с использованием антител к bassoon (показан красным) и homer (показан зеленым), как и ожидалось. Наблюдается очень мало точек синаптической колокализации. Для определения влияния секретируемых астроцитами молекул на количество синапсов, сформировавшихся in vitro, диссоциированные RG Cs каждые три дня обрабатывали кондиционированной средой мышиных астроцитов в течение 12 дней, после чего проводили окрашивание.

В этом нейроне было отчетливо видно множество синапсов, но вскоре они показаны красным цветом. Homer показан зеленым цветом; диссоциированные RDC, трансфицированные цитоплазматическим Lee экспрессирующим TD tomato, обрабатывали только базальной средой для роста. Синапсы не наблюдаются.

TD-томаты окрашены в синий цвет, синапсы — в красный. Сигнал постсинаптического маркера homer, показанного зеленым цветом, выражен очень слабо. При длительном воздействии на те же клетки кондиционированной среды астроцитов крысы наблюдается большое количество синапсов.

Здесь TD-томат показан синим цветом, синапсин — красным, а homer — зеленым. Представлена очищенная RGC, обработанная кондиционированной средой астроцитов и окрашенная на пресинаптические маркеры красным цветом и постсинаптические маркеры homer зеленым цветом; пороговые маски, созданные с помощью программы Puncta analyzer, соответствуют двум имеющимся каналам. После выявления точек колокализации Puncta analyzer выводит графическое представление этих точек.

Анализатор пунктат предоставляет числовой результат, указывающий количество отдельных пунктат, выявленных в обоих каналах, а также количество точек колокализации. Данные, полученные в результате анализа этого нейрона, иллюстрируют способность секретируемых астроцитами молекул стимулировать формирование синапсов; здесь это представлено в виде анализа синапсов, при котором количественно определялась колокализация пре- и постсинаптического иммуногистохимического окрашивания для демонстрации усиления индуцированного астроцитами синаптогенеза при оверэкспрессии нейронального рецептора к важному секретируемому астроцитами синаптогенному молекулярному фактору тромбоспондину. На данном рисунке показано среднее количество синапсов на нейрон при длительном воздействии базовой ростовой среды (gm) или кондиционированной среды астроцитов.

A-C-M-A-C-M более эффективно стимулирует образование синапсов в ганглионарных клетках сетчатки с гиперэкспрессией тромбоспондинавого рецептора по сравнению с клетками с гиперэкспрессией пустого вектора. Для количественного определения плотности синапсов в верхнем холмике мозга мыши пре- и постсинаптические компартменты были раздельно помечены с использованием компартмент-специфических иммуногистохимических маркеров. Как показано здесь, наблюдалось увеличение количества синапсов с седьмого постнатального дня до P 14.

Здесь показано увеличение количества синапсов в верхнем одностороннем затылочном ядре (superior colliculus) в течение данного периода развития. После освоения данный протокол может быть выполнен примерно за два дня для диссоциированных нейрональных культур и примерно за пять дней для срезов мозга, полученных из животного в соответствии с этой процедурой. Другие методы, такие как электрофизиология и электронная микроскопия, используются для подтверждения того, что изменения количества синапсов отражают изменения в функциональных синапсах и ультраструктурно нормальных синапсах соответственно.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как применять иммуногистохимический анализ к вашему экспериментальному препарату для количественного определения числа синапсов. В данном протоколе подробно описано, как использовать антитела, специфичные к определенным компартментам, для селективного мечения пре- и постсинаптических структур. В данном контексте под синапсами мы понимаем точки колокализации сигналов, полученных от каждого из этих маркеров.