Поведенческая фармакология в классической Кондиционирование Ответ хоботок Расширение в Медоносные пчелы ( Apis Mellifera)

Общая цель данной процедуры заключается в изучении молекулярных механизмов, лежащих в основе обучения и формирования памяти. В случае с медоносными пчелами первым этапом является сбор свободно летающих пчел из улья. Затем пчел закрепляют на пластиковых трубках.

Третьим этапом процедуры является проведение классического обусловливания. Препараты могут вводиться в определенные моменты времени относительно процесса обусловливания для изучения их влияния на обучение и формирование памяти. Заключительным этапом процедуры является тестирование сохранения памяти.

В конечном счете, изменения в поведении после введения препарата могут раскрыть молекулярные механизмы, лежащие в основе обучения и формирования памяти у медоносных пчел. Этот метод может помочь в поиске ответов на ключевые вопросы в области обучения и памяти, выявляя молекулярные механизмы формирования памяти.

В целом, исследователи, которые только начинают использовать данный метод, могут столкнуться с определенными трудностями, так как время предъявления стимулов во время кондиционирования и извлечения памяти должно быть строго выверено. Кроме того, критически важным является режим кормления. Процедура будет продемонстрирована Каттинг Гиринг и Йоханнесом Фабергом аспирантам моей лаборатории. За день до эксперимента, в период с 14:00 до 16:00, соберите пчел с помощью пирамиды из светопропускающего УФ-излучению плексигласа.

Вернувшись в лабораторию, поставьте пирамиду на основание и закройте стенки полотенцем, оставив вершину открытой. Откройте вершину и удерживайте стеклянный флакон над отверстием, позволяя одной пчеле перелететь во флакон, после чего снова закройте отверстие. Повторяйте эту процедуру до тех пор, пока все пчелы не будут перенесены в стеклянный флакон в осенний и зимний периоды.

Когда пчелы не летают на улице, улей содержат в теплице в сетке, из которой напрямую отлавливают отдельных пчел. Поместите одну пчелу в одну стеклянную виалу; иммобилизуйте пчелу, охлаждая виалу на льду в течение от двух с половиной до трех с половиной минут. Внимательно следите за пчелой и извлеките ее изо льда, как только она перестанет двигаться.

Зафиксируйте обездвиженную пчелу в небольшой пластиковой пробирке с помощью липкой ленты. Убедитесь, что пчела может свободно двигать брюшком, но не может двигать головой, грудью или ногами. Также важно не сдавливать шею.

После подготовки пчелы поместите пробирку в пронумерованное отверстие на штативе для удобства манипуляций и идентификации.

Пробирки всегда возвращаются в то же самое отверстие. После манипуляций кормите пчел в период с 16:00 до 18:00 в месте, отличном от участка кондиционирования. Вызывайте реакцию вытягивания хоботка (PER), касаясь пчел и их усиков.

С помощью раствора сахарозы дайте пчеле употребить одну каплю раствора SRA объемом около 4 µL. Следите за тем, чтобы не задеть усики, проторакс или пластиковую трубку пчелы. Кормите каждую пчелу до тех пор, пока она не перестанет принимать раствор.

Продемонстрируйте быструю и надежную ПРП (proboscis extension response), когда их антенны коснутся раствора. В последующие вечера эксперимента кормите каждую пчелу четыре раза, давая по одной капле раствора сахарозы. Наполните пластиковую чашу высотой примерно 0,5–1 см водопроводной водой.

Поместите штатив с закрепленными пчелами в чашу, используя планшеты Lysa в качестве платформы. Накройте чашу картоном и храните при комнатной температуре в течение ночи. Ольфакторное обусловливание пчел проводится около 10:00 утра на следующий день после сбора.

За 30 минут до начала эксперимента. Поместите стеллаж с пчелами в держателях рядом с местом кондиционирования, но в стороне от отверстия выхлопной трубы, где будет проходить обучение пчел. Затем, работая в вытяжном шкафу, подготовьте кондиционирующий стимул.

С помощью наконечника с фильтром перенесите 4 µL гвоздичного масла на круглый фильтровальный бумажный диск. Поместите пропитанный маслом фильтр в шприц объемом 20 мл и вставьте поршень. Настройте аудиоплеер, который будет подавать акустический сигнал экспериментатору.

Это обеспечивает точное время подачи стимула, начало и прекращение стимула, его продолжительность и местоположение. Подготовьтесь к записи поведения пчелы на протяжении всего процесса кондиционирования. Положительный балл присваивается, если пчела вытягивает хоботок (SSIS) в интервале между началом условного стимула и предъявлением безусловного стимула.

Пересечение виртуальной линии между разведенными жвалами. Чтобы начать пробу обучения, выберите пчелу для тренировки и поместите ее перед выхлопным отверстием на 10 секунд. Незадолго до окончания этого десятисекундного интервала поместите шприц с запахом на расстоянии трех сантиметров от усиков пчелы. Подавайте запах в течение пяти секунд, пропуская через шприц 20 milliliters воздуха.

Спустя три секунды предъявите безусловный стимул, коснувшись влажной зубочисткой с раствором сахарозы вентральной части дистальных флагелл обеих антенн. Чтобы раствор не попал на тело и антенны пчелы, позвольте пчеле слизать раствор с зубочистки. Данный комбинированный стимул воздействует в течение четырех секунд, после чего пчел извлекают из условий обучения и возвращают в штатив.

Один тренировочный пробный запуск длится 28 секунд, при этом кондиционирующий стимул предъявляется через 13 секунд. После интервала между пробами в 10 минут верните пчелу на место тренировки. Проведите вторую из трех проб, как было показано ранее, и подождите еще 10 минут перед выполнением финального спаривания.

По завершении ежедневного обучения верните штативы в чашу. Не забудьте покормить каждую пчелу четыре раза, используя одну каплю раствора сахарозы объемом 4 µL в период с 16:00 до 18:00. Как было продемонстрировано ранее, тесты на удержание памяти можно проводить через любые интервалы времени после обучения — от нескольких минут до нескольких дней. Перед проведением теста на память поместите штатив с пчелами рядом с местом кондиционирования на 30 минут.

Начните тестирование, поместив пчелу перед выхлопным отверстием на 10 секунд. Предъявите условный раздражитель в течение пяти секунд и зафиксируйте возникновение ПРР (пробовидной реакции). По завершении тестирования за день верните штативы обратно в чашу.

Не забудьте четыре раза покормить каждую пчелу одной каплей раствора сахарозы объемом 4 µL в период с 16:00 до 18:00, как было продемонстрировано ранее; в конце всего эксперимента убедитесь, что пчела все еще способна вытягивать хоботок, коснувшись усика раствором SRA, чтобы включить ее в анализ; пчелы должны выжить на протяжении всего эксперимента и иметь неповрежденный PER. В некоторых исследованиях для изучения влияния фармакологического воздействия на ольфакторную память используются системные инъекции. Эти инъекции могут проводиться в разное время в зависимости от дизайна эксперимента.

Для начала с помощью одноразовой гиподермической иглы сделайте небольшое отверстие в кутикуле задней части S scootin рядом с щелью S scootle над летательной мышцей. Затем наполните стеклянную капиллярную трубку одним микролитром тестируемого раствора. Вставьте капилляр в отверстие в кутикуле и введите раствор в летательную мышцу.

Обученные экспериментаторы способны вводить одну дозу B каждые 30 секунд, что позволяет точно контролировать время инъекции и кондиционирования. Здесь представлены два эксперимента. В первом эксперименте изучается влияние системной инъекции физиологического раствора, введенной перед обучением, на формирование памяти.

В данном исследовании выделено три группы: группа A, не получавшая лечения, группа, которой вводили системную инъекцию фосфатно-солевого буферного раствора в объеме 1 µL, и контрольная группа (sham). Эти процедуры проводились за 30 минут до начала обучения, показанного здесь слева. Процент животных, демонстрирующих обусловленную реакцию в процессе формирования навыка, увеличивался на протяжении трех тренировочных сессий, при этом между группами различий не наблюдалось.

Столбчатые диаграммы справа показывают, что ни инъекция PBS, ни имитация повреждения не повлияли на сохранение памяти. Спустя 24 часа после обучения во втором эксперименте инъекции проводили через 40 минут после обучения; пчелы были разделены на одну группу, получавшую физиологический раствор, и другую, получавшую один микroliter ингибитора синтеза белка anisomycin. Столбчатые диаграммы справа демонстрируют явное снижение сохранения памяти у пчел, получавших anisomycin. Эти результаты подчеркивают важность синтеза белка в формировании обонятельной памяти.

После выполнения данной процедуры можно провести электрофизиологические регистрации, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, какова нейрофизиологическая основа обучения и формирования памяти после ее развития? Этот метод открыл исследователям в области изучения обучения и памяти путь к изучению молекулярных и нейрофизиологических механизмов формирования памяти у медоносной пчелы.