Агар-Block Микрокосмы для управляемого разложения тканей завод по Аэробные Грибы

Общая цель данной процедуры заключается в инокуляции аэробного дереворазрушающего гриба в микрокосм в чашке Петри, где влажность древесины и экзогенные субстраты строго контролируются. Это достигается путем предварительного подготовки микрокосмов с точными объемами известных сред. Затем древесина, подлежащая разложению, и любые экзогенные твердые субстраты размещаются поверх пластиковой сетки на поверхности агара таким образом, чтобы исключить контакт между субстратами.

Затем микрокосм инокулируют и инкубируют с исследуемым грибом. После инкубации деревянные блоки извлекают для определения потери массы и подготовки тканей к анализу. В конечном итоге, с помощью измерений потери массы, наблюдения за морфологией мицелия и целевого элементного анализа, такого как спектроскопия с индуктивно-связанной плазмой, можно получить результаты, демонстрирующие степень биодеградации древесины и роль экзогенных источников элементов.

Здравствуйте, меня зовут Брук Джейкобсон, я представляю лабораторию доктора Джонатана Шиллинга с кафедры инженерного проектирования биопродуктов и биосистем Университета Миннесоты. Сегодня мы продемонстрируем вам методику использования чашек Петри в качестве микросред для разложения растительных тканей аэробными грибами. В нашей лаборатории мы применяем этот метод для изучения механизмов разложения лигноцеллюлозы грибами.

Лигноцеллюлоза представляет собой растительную ткань, состоящую из лигнина, целлюлозы и гемицеллюлозы. Чаще всего мы изучаем древесину; ошибки в менее технических аспектах конструкции блока шнека являются наиболее распространенными причинами неудач и основными источниками вариативности в исследованиях, что делает видеопубликацию нашей установки блока шнека полезной. Исходя из нашего опыта, мы знаем, что данная процедура обеспечивает высококачественные результаты с низкой вариативностью.

Итак, приступим. Для данных экспериментов используйте чашки Петри, которые на один сантиметр глубже стандартных, чтобы увеличить объем свободного пространства над деревянным блоком в микрокосме.

Начните подготовку микрокосма с приготовления среды в объеме 20 мл на одну чашку Петри, не содержащей кальция и железа. Добавьте 15 г агара в мерную колбу объемом 500 мл, содержащую приблизительно 400 мл деионизированной воды с добавками. Используйте заранее приготовленные стоковые растворы для внесения микроэлементов в смесь.

После добавления питательных веществ доведите объем раствора в мерной колбе до отметки 500 milliliter. Затем перенесите среду в колбу объемом 1000 milliliter. Автоклавируйте при 121 degrees Celsius и 16 PSI в течение 20 минут.

Следите за тем, чтобы объем в одной колбе не превышал 500 milliliters, чтобы предотвратить затвердевание агара до момента нанесения на тестовые чашки. После автоклавирования дайте среде остыть до температуры, комфортной при прикосновении, чтобы минимизировать конденсацию. Сведение к минимуму содержания влаги имеет решающее значение в этих экспериментах, так как содержание влаги или mc.

Более 80% приведут к аноксии в тканях. Ограничьте разложение аэробными грибами и один раз увеличьте вариабельность. Охладите. Используйте портативный контроллер для дозатора и стерильные полистирольные пипетки объемом 10 milliliter для асептического переноса.

Перенесите агар в высокую стопку чашек в боксе биологической безопасности. Затем нарежьте пластиковые сетчатые решетки так, чтобы они свободно помещались на дно чашек. После нарезки и тщательного промывания решеток водой с мылом подготовьте их к сушке и автоклавированию для данной демонстрации.

В качестве материала используется южная желтая сосна (SYP), так как она представляет собой важный источник пиломатериалов. Возьмите необработанную древесину из жилого фонда США и вырежьте безсучковые блоки размером 19 на 19 миллиметров одним продольным резом вдоль волокон. Разрежьте полученную заготовку на кубические блоки со стороной 19 миллиметров.

Разделите блоки размером 19 мм³ пополам вдоль волокон, используя стамеску и молоток вместо пилы. Таким образом, одна шероховатая грань блока будет обращена вниз к пластиковой сетке в микрокосме с сельскохозяйственным блоком, а гладкая верхняя грань будет использоваться для маркировки. Промаркируйте гладкую грань блоков карандашом; нарежьте достаточное количество блоков для всех вариантов обработки, а также неинокулированных контролей, которые будут служить как мониторами контаминации, так и базовыми образцами данных, кондиционируемыми параллельно для получения высушенного в печи материала; поместите образцы в алюминиевые лотки для сыворотки и в конвекционную печь при 100 °C на 48 часов.

Перенесите образцы из сушильного шкафа в эксикатор для их охлаждения. Взвесьте образцы для определения начальной массы сухих образцов. Наконец, подготовьте образцы, включая пластиковые сетки и древесину, к автоклавированию, плотно обернув их фольгой для минимизации увлажнения.

Это не требует индивидуальной упаковки каждого образца, однако необходимо обеспечить низкое и равномерное воздействие пара. Автоклавируйте маркированные образцы при температуре 121 °C и давлении 16 PSI в течение одного часа. В стерильном боксе биологической безопасности подготовьте пустые AE, исходную пластину для инокуляционной сетки, субстрат для растений, экзогенные материалы, маркер, параформовые полоски, пинцет и инструменты для переноса.

Следующим этапом инокуляции является помещение материалов в чашки Петри, чтобы минимизировать риск контаминации. Стерилизуйте инструменты для переноса и пинцеты в 95% ethanol по мере их использования. Сначала поместите пластиковую сетку в чашку Петри.

Затем добавьте сюда деревянный субстрат. Вдоль сетки помещают два деревянных бруска, чтобы можно было сопоставить данные раннего и позднего сбора. Бруски укладывают бок о бок волокнами, направленными в сторону источника грибкового инокулята.

Затем добавьте экзогенные материалы. В данном случае исследуется роль гипса в процессе разложения нитчатым грибом. Следовательно, гриб должен вступить в контакт с этими гипсовыми дисками до того, как достигнет древесины.

Между каждым блоком и точкой инокуляции на поверхности сетки помещают по одному гипсовому диску. Следите за тем, чтобы диски в древесине не соприкасались друг с другом, но располагались максимально близко. Для подготовки грибного инокулята используйте пробкобур №4 диаметром 7 мм, чтобы вырезать цилиндрики (плаги) из двухнедельных культур, выращенных в 20 мл агара.

Это помогает контролировать объем инокулята. Для неинокулированных контролей рекомендуется добавить пробку из стерильной чашки. Не допускайте контакта инокулята ни с экзогенными субстратами, ни с древесиной, но разместите их в непосредственной близости друг от друга.

Используйте по одному инокуляционному пробке на блок. Герметизируйте чашки парафильмом, предварительно отрезанным лезвием: удерживая чашки горизонтально, оберните их парафильмом плавным непрерывным движением. В завершение промаркируйте крышки чашек спиртостойким маркером, указывая номера блоков непосредственно над соответствующими субстратами.

Также нанесите круги поверх гипсовых дисков. Осторожно перенесите планшеты в биологический инкубатор, чтобы избежать встряхивания содержимого и минимизировать конденсацию, вызванную колебаниями температуры. В данных условиях при температуре 20 °C и в темноте проведите серию сборов образцов в разные моменты времени асептически, за исключением последнего сбора.

В точке сбора урожая на пятой неделе извлеките всю партию образцов. Обработайте каждую сторону (верхнюю и нижнюю) 70% ethanol и с помощью простерилизованных в пламени пинцета удалите материал внутри шкафа биологической безопасности. Сделайте фотографии перед уничтожением агропластин, сосредоточив внимание на любых морфах F или дыни.

Затем извлеките блоки, предназначенные для обработки. Снимите излишки pha, стараясь при этом не потерять разложившийся материал. Высушите блоки в алюминиевых лотках и определите потерю массы, используя вес свежих и высушенных контрольных образцов, чтобы проконтролировать чрезмерное вытягивание жидкости.

Данные о потере массы помогают оценить прогресс разложения и являются важными сведениями. Если расчет концентрации элементов должен производиться в пересчете на грамм веса, данные в процентах необходимо нормализовать. Для целей статистического анализа следует пометить и отслеживать все темно-коричневые блоки, которые явно перенасыщены водой.

В завершение уничтожьте культуры в автоклавируемых пакетах, сохранив пластиковую опорную сетку и любые другие компоненты, которые могут быть переработаны для использования в будущих экспериментах. В установке микрокосма с сельскохозяйственным блоком деревянные блоки из сосны располагаются на пластиковой сетке, чтобы приподнять их над зоной контакта с почвой. Круговые колонии *Crains* росли в непосредственном контакте с гипсовыми поверхностями и прорастали в деревянные блоки.

Данный мицелий представляет собой важное связующее звено между древесиной и экзогенными источниками питательных элементов. Контроль этих экзогенных источников материалов в агаре или твердых материалах является ключевым преимуществом конструкции агроблока по сравнению с конструкцией почвенного блока; здесь показан средний процент потери массы как показатель степени разложения древесины сосны в микрокосмах агроблоков после 5 и 15 недель инкубации.

Обработки не проводились. Добавление 5 мМ хлорида кальция в агар, содержащий более 99% чистого гипса или гипс с добавлением 1% железа; для каждого сбора столбцы, отмеченные одной и той же буквой, существенно не различаются. При стандартном отклонении, представленном планками погрешностей, в контрольных блоках сосны с бурой гнилью наблюдалась потеря массы более 60%, что соответствует целевому показателю стандарта Американского общества по испытанию материалов (ASTM) по разложению более 50%.

Средний коэффициент вариации распада на 16-й неделе составил 0,055. Помимо низкой вариабельности, наблюдался эффект от обработки. Добавление кальция, в виде хлорида кальция или чистого гипса в агар, подавляло грибковый распад.

Интересно, что скорость разложения восстанавливается при добавлении железа в гипс. Это позволяет предположить, что решающую роль играет железо, а не кальций, что наблюдается в пяти повторностях на 15-й неделе разложения. В случае с тем же тестовым грибом бурой гнили, цвет мицелия на круговых пластинках указывает на наличие меина.

Различия во внешних гифах между вариантами обработки: блоки были извлечены и высушены. Это выявило отсутствие мицелия в варианте без кальция, пожелтение в вариантах с чистым кальцием и появление ржавого оттенка в варианте с добавлением железа.

Контроль представляет собой неинокулированные блоки для сравнения. Интересно, что при использовании среды с высоким содержанием железа основные эффекты исчезают. В совокупности это свидетельствует о том, что данный гриб использует железо, а не кальций.

В данных материалах мы продемонстрировали, как использовать установку с буровым блоком для успешного тестирования биодеградации растительных тканей аэробными нитчатыми грибами. При выполнении этой процедуры важно помнить о необходимости предотвращать контакт субстратов друг с другом, особенно растительной ткани и бура; минимизировать содержание влаги в буре и пластинах, а также дважды проверить, не сместилось ли содержимое каждой пластины перед инкубацией. Учитывая эти переменные, вы сможете гораздо эффективнее контролировать среду разложения, чем при использовании установки с почвенным блоком.

Таким образом, вы сможете получить данные со статистической мощностью, необходимой для ответа на ваши исследовательские вопросы. На этом всё. Спасибо за внимание и удачи в проведении ваших экспериментов.