Оптимизированная стратегия Трансфекция для выражения и Электрофизиологические Запись рекомбинантных напряжением ионные каналы в НЕК-293T Клетки

Электрофизиологию часто используют для изучения активности рекомбинантных потенциал-зависимых ионных каналов в культивируемых клетках эмбриональной почки человека. Для успешной регистрации необходимо, чтобы клетки экспрессировали каналы на мембране в количествах, достаточных для детектирования, а плотность посева клеток была достаточно низкой для изоляции отдельных клеток. Проведение записей с клеток часто затрудняется длительными периодами инкубации при 28 °C, необходимыми для такой экспрессии, что обычно приводит к потере адгезии клеток и стабильности мембраны.

Здесь представлен оптимизированный метод культивирования и трансфекции клеток, позволяющий избежать этих проблем. Клетки трансфецируют при умеренной эффективности, затем инкубируют при 28 °C до достижения достаточного уровня экспрессии ионных каналов. Затем трансфецированные клетки высевают на стеклянные покровные стекла с низкой плотностью и инкубируют при 37 °C в течение нескольких часов для обеспечения прикрепления клеток и стабилизации мембраны.

После этого надлежащим образом высеянные клетки идентифицируют по коэкспрессии EGFP и с помощью метода локальной фиксации потенциала (patch clamp) на всем теле клетки. Можно приступить к регистрации или повторно инкубировать клетки при 28 °C. Для дальнейшего повышения экспрессии каналов на поверхности клетки результаты экспериментов по регистрации на клетках, трансфицированных потенциалзависимыми кальциевых каналами, такими как L CAV 1, L CAV 2 или L cav 3, указывают на то, что каналы были успешно трансфицированы и экспрессированы клетками.

Хотя представлены результаты только для L CAV three, в нашей лаборатории был разработан метод усиления экспрессии плохо экспрессируемых генов ионных каналов для проведения патч-кламп регистрации в клеточных линиях человека. В настоящее время общепринятый подход заключается в том, чтобы сначала высеять клетки на покровные стекла и трансфицировать их плазмидными кДНК, содержащими гены ионных каналов, а затем инкубировать их в течение нескольких дней при 28 °C для достижения высокой эффективности экспрессии ионных каналов перед электрофизиологической записью. Наш новый подход значительно сокращает время инкубации при 28 °C, необходимое перед началом регистрации.

Теперь, сократив время инкубации при 28 °C, мы обнаружили, что клеточные мембраны становятся гораздо более стабильными, а трансфецированные клетки намного лучше прикрепляются к покровным стеклам. Это увеличивает количество регистрируемых клеток и значительно повышает эффективность экспериментирования. Перед трансфекцией перенесите клетки HEK 2 9 3 T из полностью конфлюэнтного флакона в соотношении от 1:4 в новый флакон объемом 25 cm² и поместите клетки в инкубатор при 37 °C и 5% CO₂.

Оставьте клетки для прикрепления на три-четыре часа; через четыре часа изучите клетки с помощью дифференциального интерференционного контраста, чтобы подтвердить прикрепление. Обратите внимание, что клетки больше не выглядят округлыми и становятся плоскими. Видны отростки или псевдоподии.

Клетки с меньшей степенью конфлюэнтности будут выглядеть так же, но будут расположены дальше друг от друга. После прикрепления клеток смешайте необходимые реагенты для проведения стандартной трансфекции фосфатом кальция. Подготовьте в общей сложности 12 µg ДНК в 600 µL раствора для трансфекции на одну колбу.

Здесь кДНК различных ионных каналов клонированы в плазмиду P-I-R-E-S two EGFP. Трансфекция этого экспрессионного вектора в клеточную линию млекопитающих приводит к продукции усиленного зеленого флуоресцентного белка из той же мРНК, что и клонированная вставка, за счет трансляции, инициируемой на внутреннем сайте связывания рибосомы, расположенном сразу после последовательности кодирования ионного канала и перед последовательностью кодирования EGFP. Это позволяет идентифицировать успешно трансфицированные клетки, исключая возможные помехи в функции белка, которые могли бы возникнуть при прямом слиянии белка EGFP с исследуемым белком.

Покапельно внесите раствор для трансфекции на клетки, затем осторожно перемешайте содержимое колбы круговыми движениями и поместите её в инкубатор при 37 °C на ночь. На следующий день оцените эффективность трансфекции, исследуя клетки с помощью флуоресцентного микроскопа. Успешно трансфицированные клетки должны иметь равномерное зеленое окрашивание по всему объему.

После подтверждения успешности трансфекции осторожно перенесите пипеткой четыре-пять миллилитров подогретой среды в перевернутый флакон. Промойте клетки, медленно переворачивая флакон так, чтобы поверхность с клетками оказалась снизу, и аккуратно покачивая его, чтобы промывочный раствор мягко омывал клетки. Удалите среду и повторите промывку.

Повторите перемешивание еще дважды. Затем добавьте в колбу шесть миллилитров среды и инкубируйте при 37 °C в течение двух часов. Экспрессия ионных каналов беспозвоночных сопряжена с определенными трудностями.

Во-первых, они часто имеют большой размер и, следовательно, могут требовать много времени для трансляции на эндоплазматическом ретикулуме. Кроме того, они могут неэффективно направляться к клеточной мембране в клеточных линиях млекопитающих. Наконец, поскольку разные виды демонстрируют различную частоту использования кодонов, гетерологичные кДНК могут содержать высокую частоту кодонов, которые редко встречаются в клетках млекопитающих, таких как HEK 2 9 3 T, что создает определенные трудности.

После двухчасовой инкубации при 37 °C после промывки трансфектата перенесите флаконы в инкубатор при 28 °C на период от двух до шести дней для продления периода экспрессии. Время инкубации необходимо определить эмпирическим путем для каждого типа экспрессируемого ионного канала, поскольку длительная инкубация при 28 °C приводит к откреплению клеток и снижению стабильности мембраны.

Перед проведением электрофизиологических исследований требуется дополнительная подготовка клеток. Сначала удалите среду из трансфицированных клеток с помощью аспирационной пипетки, затем внесите 1 мл раствора трипсина при 37 °C в перевернутую колбу. После этого аккуратно верните колбу в исходное положение (поверхностью клеток вниз), чтобы трипсин равномерно распределился по клеткам.

Переверните колбу и удалите трипсин. Затем добавьте 250 µL теплого трипсина непосредственно на клетки и инкубируйте при 37 °C в течение трех-пяти минут до тех пор, пока клетки не открепятся. Тем временем поместите от трех до восьми покровных стекол, покрытых поли-L-лизином, в чашку для культивирования диаметром 60 мм и добавьте 5 mL теплой культуральной среды.

После того как клетки открепятся, суспендируйте их в четырех миллилитрах теплой среды, прокачав раствор пипеткой примерно шесть раз. Затем с помощью наконечника микропипетки прижмите покровные стекла, чтобы убедиться, что они находятся на дне чашки. После этого добавьте от 250 до 500 µL суспензии клеток. Инкубируйте клетки при 37 °C в течение трех часов, чтобы они прикрепились к покровным стеклам.

Слишком длительное пребывание клеток при 37 °C приведет к их делению и разбавлению трансфицированных плазмид. Трансфицированные клетки следует высеивать с достаточно низкой плотностью, чтобы они были изолированы друг от друга, как показано здесь. Это облегчит проведение электрофизиологической регистрации.

Для клеток, требующих вспомогательных субъединиц, часто необходимо перенести клетки при температуре 28 °C и инкубировать их еще в течение трех-четырех дней перед электрофизиологической записью. Запись проводится для клеток, не требующих вспомогательных субъединиц. Запись может быть выполнена сразу после данной инкубации.

Используемая здесь установка для электрофизиологии включает усилитель, моторизированные двухканальные манипуляторы для пипеток, эпифлуоресцентный микроскоп и системы перфузии. Оборудование установлено на виброизоляционном столе. Паразитные электрические шумы ограничены клеткой Фарадея второго типа высотой 40 дюймов. Системы электронного управления включают ПК, оснащенный Digidata 1440 (интерфейсом аналого-цифрового преобразователя) в сочетании с программным обеспечением pClamp 10.1.

Усилитель монитора компьютера, моторизованный манипулятор и система управления подачей через клапанный блок установлены снаружи клетки Фарадея. Все электрооборудование на свободностоящей 19-дюймовой металлической электротехнической стойке заземлено через медный распределитель и подключено к медицинскому развязывающему трансформатору, который обеспечивает изоляцию сети, стабильное заземление и подавление скачков напряжения. В качестве подготовки к экспериментам установите на держатель микропипеток на головке микроманипулятора микропипетки с огневым полированием и сопротивлением от 2 до 5 МОм.

Патч-пипетки заполняют внутренним раствором, затем слегка постукивают по ним для удаления пузырьков воздуха и в конечном итоге устанавливают на головку микроманипулятора. Далее с помощью пинцета переносят покровное стекло с нанесенными клетками в пластическую чашку Петри диаметром 35 мм, содержащую 3 мл внешнего регистрирующего раствора при комнатной температуре. Объем регистрирующего раствора должен быть измерен точно при проведении экспериментов с лекарственными препаратами, в ходе которых известные количества препарата добавляют в чашку с помощью микропипетки; затем чашку помещают на предметный столик микроскопа.

Затем заполните полуячейку держателя микроэлектрода трехмолярным раствором хлорида цезия. Вставьте электрод сравнения в полуячейку и с помощью микроманипулятора поместите заземляющий электрод в ванну, после чего опустите патч-пипетку в раствор ванны. Визуализируйте клетки в режиме флуоресценции и центрируйте отдельную позитивно трансфицированную адгезирующую зеленую клетку в центре поля зрения.

В режиме работы в ванночке подведите патч-пипетку вплотную к клетке. Обнулите запись прямоугольного импульса, отображаемую на экране компьютера. Отрегулируйте положение патч-пипетки так, чтобы она лишь касалась клетки, при этом запись прямоугольного тока на экране должна начать колебаться.

Осторожно создайте отрицательное давление с помощью присоединенного шприца до формирования гигаомного контакта. После достижения гигаомного контакта переключите программу в режим патч-кламп. С помощью шприца приложите короткий импульс всасывания, чтобы прорвать мембрану клетки.

Затем переключитесь в режим клетки (cell mode) и используйте параметры для целой клетки на усилителе. Чтобы компенсировать емкостный переходный процесс, необходимо уравновесить патч, чтобы внутриклеточный регистрирующий раствор диализировался в патчированной клетке. Здесь введите протоколы фиксации потенциала, прописанные для данного эксперимента.

Экспериментатор разработал протокол для измерения ионных токов через потенциалзависимые ионные каналы, возникающих при модуляции напряжения на клеточной мембране. В данном случае рассматривается протокол вольт-амперной характеристики (ВАХ), согласно которому программное обеспечение удерживает клетку при потенциале -110 millivolts, а затем переключает его на -70 millivolts на 250 milliseconds. Затем потенциал возвращается к удерживающему значению -110 millivolts; при этом каждый последующий шаг увеличивается на 10 millivolts, так что шаги составляют -70 millivolts, -60 millivolts и так далее, пока последний шаг не достигнет +20 millivolts.

Фильтруйте зарегистрированные токи на частоте 10 килогерц с использованием низкочастотного фильтра Бесселя на усилителе и оцифруйте с частотой дискретизации два килогерц с помощью программного обеспечения clamp X 10.1; используйте только записи с минимальной утечкой, составляющей менее 10%. Для анализа клетки HEK 2 93 T культивировали и трансфицировали тремя кальциевыми каналами L Cav, как показано здесь. Успешная трансфекция кДНК гетерологичных ионных каналов подтверждалась флуоресценцией, генерируемой вектором P-I-R-E-S two eeg FP.

Здесь мы демонстрируем успешную экспрессию беспозвоночного кальциевого канала трех типов Cav. В нетрансфицированных клетках кальциевые токи не вызываются, в то время как в трансфицированных клетках при применении протоколов фиксации потенциала всей клетки (whole cell voltage clamp) регистрируются значительные токи.

Экспериментаторы могут использовать различные электрофизиологические условия и режимы анализа данных в зависимости от своих задач. При выполнении данной процедуры важно полагаться на собственный опыт при определении сроков проведения экспериментов. Поскольку разные каналы экспрессируются на клеточной мембране с разной эффективностью, выбор оптимальной стратегии для повышения жизнеспособности клеток и максимальной экспрессии интересующих вас каналов на поверхности мембраны остается на ваше усмотрение.

Мы надеемся, что после просмотра этого видео вы получили четкое представление о том, как культивировать и поддерживать линию клеток человека, а также о том, как трансфицировать эти клетки кДНК гетерологичных ионных каналов и кДНК их субъединиц для проведения электрофизиологической регистрации.