Выделение головного и спинного мозга одноядерных клеток Использование Перколла Градиенты

Иммунные клетки инфильтрируют центральную нервную систему при инфекциях, травмах, аутоиммунных процессах или нейродегенерации. Хотя гистохимические подходы позволяют определить локализацию инфильтрующих клеток и проанализировать связанную с этим патологию, данные методы ограничены количеством антител, которые можно использовать одновременно. В данной работе представлен метод быстрого выделения мононуклеарных клеток из тканей головного и спинного мозга, при котором предварительно проводится гомогенизация эксцизированной ткани.

Затем создается градиент плотности Percoll, и после центрифугирования мононуклеарные клетки собирают с границы раздела фаз. В завершение клетки промывают и окрашивают антителами. С помощью анализа методом проточной цитометрии дифференцируют гематогенные клетки и микроглию надзора, что позволяет определить их относительные пропорции при различных патологических состояниях. Основным преимуществом данного метода перед существующими способами, такими как градиент Ficoll или гистохимический анализ, является меньшая временная затратность.

Это позволяет обрабатывать большее количество тканей одновременно. Демонстрацию настройки градиента проведет техник из моей лаборатории. Подготовьте реагенты, которые понадобятся для данного протокола. Начните с четырех миллилитров стокового изотонического раствора перфузии (SIP) на один мозг.

Для этого смешайте девять частей perol с одной частью 10-кратного HBSS без кальция и магния путем инверсии. Затем приготовьте 70% per call, смешав полученный SIP с 1-кратным HBSS без кальция и магния. После этого дозируйте два миллилитра 70% per cole в коническую полипропиленовую пробирку объемом 15 миллилитров для сбора ткани.

Для данной процедуры поместите препарированные головной и спинной мозг всех подопытных мышей в стаканы, содержащие 10 мл RPMI, на льду. Затем перенесите ткани в гомогенизатор объемом 7 или 15 мл, содержащий 3 мл 1× HBSS. С помощью пестика с неплотным прилеганием осторожно приготовьте клеточную суспензию, затем замените его на пестик размера B с плотным прилеганием и проведите дальнейшую диссоциацию тканей.

После гомогенизации ткани добавьте RPMI или 1× HBSS до конечного объема 7 мл и переходите к созданию градиента PERCOCO. Начните с добавления 3 мл SIP в суспензию клеток до конечной концентрации PERCOCO 30%. Имейте в виду, что PERCOCO следует использовать при комнатной температуре. При использовании холодного раствора клетки склонны к слипанию, что снижает эффективность разделения клеток.

Затем, используя дозатор с установленным режимом гравитационного подачи, медленно нанесите 10 миллилитров клеточной суспензии поверх 70% SIP. Избегайте перемешивания 70% и 30% растворов. Это самый критический этап процедуры.

На границе раздела растворов 70% и 30% должна быть видна четкая горизонтальная линия. Как правило, у новичков в этом методе возникают сложности, так как третий раствор и 70% раствор перемешиваются во время послойного нанесения. Следующий шаг: для стабилизации интерфейса центрифугируйте пробу в течение 30 минут при 500 Gs и 18 °C.

Убедитесь, что центрифуга остановится с минимальным торможением или без него, чтобы интерфейс не был нарушен. После центрифугирования градиентов в верхней части пробирки должен накопиться толстый вязкий слой дебриса. Следующий слой представляет собой желтоватый 30%-ый слой Percoll, который иногда может содержать дебрис.

Следующим является интерфейс между 70% и 30% слоями, который должен иметь четко выраженный белый ореол и содержать мононуклеарные клетки. Наконец, в нижней части пробирки находится прозрачный слой 70% фиколла. Если интерфейс не наблюдается, выход клеток, скорее всего, будет очень низким, что крайне затруднит дальнейший анализ.

Следовательно, на данном этапе может потребоваться использование свежих клеточных суспензий для снижения уровня загрязнения. Осторожно удалите слой клеточного детрита с поверхности пробирки и утилизируйте его. Затем с помощью пластиковой пипетки пройдите через верхний слой (30% от общего объема) и соберите два-три миллилитра интерфазы 70/30, перенеся ее в чистую коническую пробирку, содержащую восемь миллилитров 1× HBSS.

Несколько раз перемешайте разведенные интерфейсы путем инверсии, затем центрифугируйте в течение семи минут при 500 GS при 18 °C. После центрифугирования удалите супернатант и ресуспендируйте осадок. Перенесите клеточную суспензию в пробирку объемом 1.5 мл с одним миллилитром буфера для окрашивания клеток и промойте ее еще один раз.

Перед началом окрашивания антителами центрифугируйте образцы в микроцентрифуге при 10 000 GS в течение одной минуты при температуре четырех градусов Цельсия. Для блокирования сайтов связывания FC-фрагмента ресуспендируйте осадки в 50 µL очищенных антител anti-US CD 16, CD 32, разведенных 1:200 в буфере для окрашивания клеток. Как и при любой процедуре окрашивания, крайне важно, чтобы все антитела были надлежащим образом титрованы; инкубируйте на льду в течение 10 минут. Во время инкубации отберите от двух до пяти µL суспензии клеток и подсчитайте их с помощью гемоцитометра.

Объединенные ткани наивного мозга и спинного мозга должны давать примерно от трех до пяти × 10⁵ клеток на одну мышь. В воспаленных мозолях количество воспалительных клеток будет варьироваться в зависимости от момента сбора материала и модели заболевания. После инкубации с CD 16 и CD 32 добавьте 50 µL смеси коктейля специфических антител к иммунным клеткам. Смесь, используемая в данном примере, содержит антитела против CD 45, CD 4 и CD 19; инкубируйте на льду в течение 30 минут.

Важно предварительно провести титрование каждого антитела. Для определения оптимального разведения используйте соответствующие комбинации флуорохромов, выбранные в соответствии с возможностями лазеров и настройками фильтров вашего конкретного проточного цитометра. После окрашивания клеток промойте их в буфере для окрашивания клеток, добавив 1 мл буфера для окрашивания клеток и центрифугируя в течение одной минуты.

После центрифугирования при 10 000 G удалите супернатант, затем ресуспендируйте осадок в 100–200 µL буфера для окрашивания клеток для немедленного анализа методом проточной цитометрии или для последующего анализа. Ресуспендируйте клетки в 2% параформальдегиде, приготовленном в PBS, и храните в течение ночи при 4 °C. Здесь представлены мононуклеарные клетки, полученные и инкубированные с FC-блоком с последующим добавлением антител к CD45, CD4 и CD19.

В соответствии с продемонстрированным протоколом, окрашивание на CD 45 методом проточной цитометрии позволяет четко отделить гематогенные клетки с высоким уровнем экспрессии CD 45 от микроглии с низким уровнем экспрессии CD 45 (CD 45 DIM). На данном рисунке представлено сравнение клеток, выделенных из мозга наивной мыши и мыши с воспалением, у которой был индуцирован экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит. По оси Y показана интенсивность сигнала CD 45, при этом в мозге наивной мыши визуализируются три отчетливые популяции.

Обнаруживается очень небольшое количество клеток с высоким уровнем экспрессии CD 45. Обычно они составляют менее 2% от всей изолированной популяции. Для сравнения, в головном мозге мышей с ЭАЭ наблюдается массивный приток рекрутированных в мозг клеток крови.

Добавление других маркеров клеточной поверхности, таких как CD 11 b, CD 4, CD 8 и так далее, позволяет дополнительно охарактеризовать популяцию CD 45 high. После освоения эта методика может быть выполнена за три-четыре часа при соблюдении всех правил. При проведении этой процедуры важно помнить, что гистологические подходы в сочетании с иммунофенотипированием методом проточной цитометрии имеют решающее значение для полной характеристики состава воспалительных инфильтратов ЦНС.