Пептидов из библиотеки Показать Фаг Модуляция экспрессии генов в клетки и мезенхимальные Потенцирует остеогенез в Unicortical костных дефектов

Общая цель данного эксперимента заключается в выявлении последовательностей, которые потенцируют дифференцировку мезенхимальных клеток и способствуют восстановлению костной ткани. Первым этапом является изоляция фагов, связывающихся с костью, методом биопаннинга. Далее следует определить пептидные последовательности, которые связываются с мезенхимальными клетками, а также установить последующие изменения в экспрессии генов.

Проведите эксперименты, чтобы определить способы доставки пептидных последовательностей в костную ткань для регенеративных целей. В качестве заключительного этапа проведите гистологическое исследование восстановления кости; совокупность полученных результатов может дать важную информацию о механизмах дифференцировки клеток in vitro и восстановления кости in vivo. Преимущества использования метода биопаннинга с библиотекой фагового дисплея заключаются в том, что нам удалось идентифицировать пептиды, которые нацеливаются на костную ткань и могут быть использованы для стимулирования дифференцировки мезенхимальных клеток и усиления восстановления кости.

В конечном итоге эти пептидные последовательности могут быть полезны при применении терапевтических методов восстановления костной ткани и лечения заболеваний, сопровождающихся потерей костной массы, таких как остеопения и остеопороз. Основываясь на исследовании ULA и Pascal, в котором было показано, что биопаннинг может быть использован для изоляции пептидных последовательностей, воздействующих на кровеносные сосуды, мы решили адаптировать этот метод для изучения механизмов в костной ткани. Для проведения процедуры биопаннинга in vivo через сердце 10-недельной мыши линии valve C перфузировали 10¹⁰ бляшкообразующих единиц фаговой библиотек пептидов N-E-B-P-H-D 12.

Примерно через пять минут эвтаназируйте мышь, обнажите и препарируйте бедренные кости, отсеките концы и извлеките костный мозг. Промойте левую бедренную кость внутри и снаружи раствором PBS 10 раз. Затем поместите кость в суспензию бактерий ER 2 5 3 7.

Для удаления несвязавшихся фагов промойте промежуточный канал правой бедренной кости 10 раз, используя шприц с иглой 21 G и 2% раствор сухого обезжиренного молока. Затем элюируйте связавшиеся фаги из промежуточного канала буфером из глицина и соляной кислоты с pH 2,2, нейтрализованным 1 M Tris.

Для амплификации фага добавьте EIT к бактериям ER 2 5 3 7 и культивируйте в течение 4,5 hours. Осторожно перенесите супернатанты в чистые пробирки и осадите фаг трижды путем добавления полиэтиленгликоля. Раствора хлорида натрия, инкубируйте пробирки в течение ночи при температуре four °C.

Наконец, ресуспендируйте осадок в TBS с 0,02% Sodium azide. Высейте фаги на чашки для определения количества бляшкообразующих единиц амплифицированных EITs. Повторите процедуру биопанирования in vivo четыре раза как для элюированных, так и для неэлюированных фагов.

Проведите амплификацию пула фагов в бактериальных культурах. Очистите и количественно определите последовательность ДНК (конечную ДНК фага), используя праймер 98, входящий в набор для фагового дисплея. Важно рассчитать частоту представления последовательности ДНК фага.

Теперь синтезируйте пептиды, содержащие последовательность-затравку glycine glycine glycine sine lysine, и культивируйте клетки D1 — клонированную линию мультипотентных стромальных клеток костного мозга мыши, разработанную в нашей лаборатории, — до достижения 90% конфлюэнтности. Обработайте клетки трипсином, центрифугируйте для получения осадка и подсчитайте их количество для окрашивания пептидами; высейте клетки на предметные стекла с камерными лунками, покрытые желатином, и культивируйте в течение 24 часов.

Промойте клетки раствором PBS и зафиксируйте 4% паральдегидом в течение 30 минут. Затем проведите блокировку с использованием глицина, после чего примените BSA Aden и блокирующие растворы BBSA с биотином.

Добавьте 100 µM биотинилированных пептидов L7 и R1. Промойте клетки трижды раствором PBS по пять минут каждый раз. Добавьте раствор LOR stripping в разведении 1:1000, накройте планшет крышкой и фольгой, затем инкубируйте в темном шкафу в течение 30 минут.

Промойте клетки и закрепите покровные стекла с помощью среды для заключения Vector Shield. Проведите анализ препаратов с использованием флуоресцентного микроскопа за 24 часа до операции. Замочите цилиндры из гелевой губки.

Перенесите цилиндры из гель-губки, содержащие 20 мкМ пептида L7 или R1, либо PBS-буфер без пептида, в стерильные 12-луночные культуральные планшеты и выдержите в холодильнике в течение ночи при температуре 4 °C перед операцией. Храните композит из гель-губки на льду до момента использования.

Используя пневматический бор при орошении физиологическим раствором, создайте крупный продолговатый однокортикальный дефект шириной 3 мм и длиной 8 мм. Заполните костный дефект подготовленными гелевыми пенами, аккуратно вбивая все имплантируемые скаффолды легкими постукиваниями. Эвтаназируйте крыс и извлеките большеберцовые кости в установленные моменты времени, внимательно проверив наличие костного дефекта, после чего зафиксируйте извлеченные кости в 10% нейтральном забуференном формалине для последующего заливания в парафин и изготовления срезов.

Наконец, окрасьте все срезы тканей гематоксилином и эозином для визуализации костного матрикса. Флуоресцеин-изотиоцианатная метка Aden позволяет микроскопически обнаружить связывание пептидов с клетками, выращенными in vitro. В данной работе пептиды связываются с мезенхимальными клетками в культуре для определения остеогенного эффекта пептидов на клетки.

Мезенхимальные клетки, культивируемые in vitro, могут быть обработаны тестовыми пептидами для определения изменений в морфологии клеток. Например, на четвертый день клетки начинают агрегировать, и со временем агрегаты увеличиваются, образуя узелки. Примечательно, что срез костной ткани, окрашенный гематоксилином и эозином, проявляет автофлуоресценцию при УФ-освещении.

Этот более выраженный контраст между костной и некостной тканями облегчает проведение анализа по количественному определению содержания кости в срезах для оценки восстановления костной ткани в дефектах, обработанных Gelfoam с добавлением пептида. По сравнению с применением только Gelfoam, в дефектах, заполненных составом с пептидом, со временем наблюдалось наибольшее восстановление кортикального слоя. При выполнении данной процедуры крайне важно быть предельно методичным при вводе данных из-за большого количества образцов, которые неизбежно накопятся к моменту выбора окончательной группы пептидов.

Разработка метода биопаннинга in vivo для идентификации пептидов, нацеленных на костную ткань, открывает возможности создания потенциальных лекарственных препаратов, которые могут быть использованы для терапии восстановления костей и лечения костной резорбции. Один из механизмов, лежащих в основе восстановления кости, также задействован в процессе потери костной массы. Более детальное понимание этих механизмов и наличие инструментов, которые можно использовать для лечения таких заболеваний, как замедленное сращение переломов и остеопороз, помогут усовершенствовать методы терапии, разрабатываемые для здравоохранения.