Криоконсервация корковые блоки ткани для генерации высоко обогащенного нейронных культур

Здравствуйте, меня зовут Алан, я работаю в лаборатории доктора Хорни Лу на кафедре нейробиологии и поведения Калифорнийского университета в Ирвайне. А я — Боб. Сегодня доктор Лу продемонстрирует вам быстрый, эффективный и надежный протокол рутинной криоконсервации блоков ткани коры головного мозга для последующего получения высококачественных первичных культур нейронов.

Итак, приступим. Очищенную и измельченную ткань помещают в криопробирки, содержащие 10% TMSO среду для замораживания.

Криопробирки помещают в контейнер для замораживания и выдерживают при температуре -80 °C не менее четырех часов. Затем замороженные криопробирки переносят в жидкий азот для длительного хранения. Для культивирования криопробирку с AC размораживают на теплой водяной бане и промывают теплым HBSS для удаления остатков DMSO.

Для диссоциации добавляют свежий HBSS с трипсином, после чего добавляют DMM с 10% EBS. Чтобы остановить ферментативную активность диссоциации, клетки осаждают центрифугированием, а осадок ресуспендируют в свежем DMM с 10% EBS и высевают на предварительно покрытые полилизином планшеты. Через 24 часа DMM заменяют на дополненную нейробазальную среду, в которой клетки культивируют в течение 10 дней.

В данном протоколе для измельчения тканей коры перед использованием применяется стальное лезвие бритвы. Лезвие необходимо стерилизовать в 70% ethanol в течение не менее двух часов. 1x сбалансированный солевой раствор Хэнкса HBSS готовят путем разведения 10x стокового раствора в стерилизованной воде; затем 1x HBSS хранят на льду или при температуре 4 °C до начала обработки тканей.

Диметилсульфоксид или DMSO используется в качестве криопротектора в среде для замораживания. В данном протоколе используется 10%-ное объемное разведение DMSO в 1X HBSS; раствор следует тщательно перемешать перед хранением при температуре 4 °C. Для контроля скорости замораживания образцов используется контейнер для замораживания Nalgene.

В контейнер для замораживания помещают криопробирки объемом 2.5 milliliter, которые были промаркированы заранее. Также рекомендуется промаркировать сами контейнеры для замораживания, если их несколько, и указать соответствующий контейнер на пробирке. Ранее охлажденный 10% DMSO, среда для замораживания, а также контейнер для замораживания помещаются в стерильный шкаф биологической безопасности.

Затем в каждый криофлакон медленно добавляют 1 мл среды для замораживания. Убедившись в плотности закрытия крышек, поместите контейнер с флаконами при температуре 4 °C минимум на два часа непосредственно перед обработкой ткани. Ранее стерилизованное лезвие бритвы необходимо тщательно промыть: выполнить три промывки по три минуты каждая.

Для удаления остатков этанола должно быть достаточно использования стерилизованной воды. Эту процедуру промывки следует проводить быстро, так как лезвие подвержено окислению при длительном погружении в стерильную воду. Перед очисткой ткань следует поместить на ледяную грелку.

Слегка промойте холодным X-H-B-S-S, чтобы удалить любые свободно плавающие частицы. Для очистки фрагментов ткани от остаточных мембран и кровеносных сосудов используйте стерильные иглы. При очистке необходимо соблюдать осторожность, чтобы сохранить структурную целостность ткани.

По мере увеличения этого показателя эффективность измельчения очищенной ткани будет заметно отличаться от измельчения сырой ткани; при этом большая часть мембран или кровеносных сосудов должна быть удалена. После того как ткань была очищена и промыта, можно приступать к измельчению. Важно делать ровные срезы ткани, создавая блоки размером примерно один миллиметр кубический.

Слишком крупные блоки приводят к снижению выхода клеток при размораживании. Однако при использовании более мелких блоков следует также избегать избыточной обработки. Измельченную ткань можно собрать с помощью автоматического дозатора и охлажденного раствора X-H-B-S-S.

Обязательно промойте чашку раствором HBSS, чтобы собрать всю извлеченную ткань. Затем ткань помещают в большой объем 1X HBSS и дают ей осесть на дно, чтобы образовался рыхлый осадок. Это позволяет удалить любые оставшиеся частицы мусора. Пока ткань оседает в HBSS, подготовьте предварительно охлажденный контейнер для заморозки и криопробирки перед распределением ткани.

Обязательно откройте все флаконы, чтобы ускорить процесс заполнения тканей. Время воздействия DMSO при комнатной температуре не должно превышать 10 минут. Рекомендуется работать с одним контейнером для заморозки за раз, пока не будет использована вся ткань.

Начните аспирировать супернатант из рыхлой ткани, подходя наконечником как можно ближе к осадку, чтобы не потревожить его. Затем установите на пипетку наконечник с широким отверстием объемом 200 µL. Не используйте наконечники с меньшим диаметром отверстия, так как это нарушит структуру блоков, оседающих на дно осадка тканевого блока.

Медленно соберите 200 мкл ткани. Поместите ткань в криопробирку и повторите процедуру для остальных пробирок, пока все они не будут заполнены. Может потребоваться соблюдение «правила 10 минут».

Быстро поместите контейнер для замораживания с криопробирками в морозильную камеру при температуре -80 °C минимум на четыре часа или на ночь, если время ограничено. По истечении этого времени извлеките контейнер из морозильной камеры и как можно быстрее перенесите криопробирки в криобокс. Поместите криобокс в штатив для хранения в жидком азоте для долгосрочного хранения.

Как можно быстрее извлеките криопробирку из жидкого азота, максимально ограничив воздействие комнатной температуры на криобоксы. Быстро разморозьте образец, погрузив его в водяную баню при 37 °C. Всегда держите крышку выше уровня воды. Часто проверяйте образец и продолжайте разморозку до тех пор, пока не останется небольшого кристалла льда.

Перед помещением в бокс биологической безопасности стерилизуйте криопробирку 70% этанолом. Если ткани остались на стенках криопробирки, перенесите размороженную ткань в большой объем теплого 1X HBSS. Осторожно соберите ткани с помощью HBSS.

После сбора всей ткани переверните пробирку три-четыре раза и дайте ткани осесть на дно. Этот шаг обеспечивает достаточное разведение DMSO.

После того как ткань осядет, аспирируйте максимально возможный объем супернатанта. Затем добавьте к нему 10 мл подогретого свежего 1X HBSS. Добавьте 300 µL 0,25% трипсина и 50 µL DNase.

Продолжите диссоциирование ткани при осторожном перемешивании до получения мутной клеточной суспензии. Остановите ферментативную активность, добавив теплый DMEM с 10% обогащенной бычьей сывороткой. Центрифугируйте клеточные суспензии при 1200 G в течение пяти минут. Ресуспендируйте клеточный осадок в свежем DMEM с 10% EBS и высейте на планшеты, покрытые полилизином.

Дайте клеткам прикрепиться к чашкам в течение 30 минут. Затем замените среду на свежий DM с добавлением 10% EBS. Через 24 часа замените среду на основе DM на нейробазальную среду с добавками N2 и B27 и культивируйте клетки в течение 10 дней.

Мы подробно описали обширный, эффективный и надежный протокол рутинной криоконсервации блоков ткани коры головного мозга. Желаем успехов.