Митохондриальная Изоляция от скелетных мышц

Общая цель данной процедуры заключается в выделении митохондрий и проведении анализа митохондриального дыхания. Для этого сначала из крыс линии Sprague Dawley выделяют скелетные мышцы. Затем мышцы гомогенизируют, а митохондрии выделяют с помощью центрифугирования.

Затем определяют концентрацию белка с помощью метода Брэдфорд. В завершение с помощью полиграфии измеряют митохондриальное дыхание. В итоге можно получить результаты, демонстрирующие потребление кислорода при различных состояниях митохондриального дыхания.

Данный метод может помочь в решении ключевых вопросов в области изучения скелетных мышц, например, в исследовании влияния различных воздействий на функцию митохондрий. Хотя этот метод позволяет получить представление о метаболизме скелетных мышц, его также можно применять к другим органам, таким как печень, мозг, почки или практически любой другой ткани. Перед началом процедуры для выделения скелетных мышц приготовьте следующие растворы: PBS, PBS с добавлением 10 mM EDTA, буфер для выделения митохондрий 8x, буфер для выделения 1 (IB1), буфер для выделения 2 (IB2) и экспериментальный буфер (EB).

Инструкции приведены в прилагаемом письменном протоколе. Затем включите центрифугу и установите температуру 4 °C. Включите водяную баню и установите температуру 37 °C.

В подходящий контейнер, помещенный на лед, положите три стакана по 10 мл, стеклянный пестик, гомогенизатор тканей, маленькие хирургические ножницы и 10 микроцентрифужных пробирок. Все компоненты должны оставаться холодными на протяжении всего эксперимента. Поместите IB 1 и IB 2 на лед, а EB — в водяную баню с теплой водой.

Затем добавьте следующие растворы в три стакана, находящихся на льду: в первый стакан — 10 milliliters PBS, во второй — 10 milliliters PBS-EDTA, в третий — 3 milliliters ib. 1. Эвтаназируйте крысу в соответствии с процедурами, утвержденными местным институциональным комитетом по уходу и использованию животных.

Затем быстро изолируйте 250–500 миллиграммов скелетных мышц с помощью пинцета и ножниц Mayo. Промойте образец в бекере один, затем перенесите его в бекер два для гомогенизации мышц. Сначала перенесите его в бекер три и, наконец, измельчите ножницами.

Перенесите раствор в гомогенизатор Potter-Elvehjem и гомогенизируйте мышечную ткань с помощью моторизованного пестика 10 раз, постоянно удерживая пробирку на льду. Затем перенесите гомогенат в предварительно охлажденные микроцентрифужные пробирки объемом 2 мл и центрифугируйте при 700 ×g в течение 10 минут при температуре 4 °C. Перенесите супернатант в новую предварительно охлажденную микроцентрифужную пробирку, а осадок удалите.

Центрифугируйте супернатант при 10 500 G в течение 10 минут при температуре 4 °C, перенесите супернатант в новую предварительно маркированную микроцентрифужную пробирку и обозначьте ее как SN1 и тип мышцы. Ресуспендируйте осадок в 500 µl буфера IB2, затем центрифугируйте при 10 500 G в течение 10 минут при температуре 4 °C. Перенесите супернатант в новую предварительно маркированную микроцентрифужную пробирку и обозначьте ее как SN2 и тип мышцы.

Ресуспендируйте итоговый митохондриальный осадок в 100 µL буфера IB two. Центрифугируйте в мини-центрифуге в течение нескольких секунд. При наличии осадка перенесите супернатант в новую предварительно заполненную микроцентрифужную пробирку, а осадок удалите. Калибровка кислородного электрода является ключевым этапом данного протокола и должна проводиться ежедневно.

Калибровку электрода можно провести во время выделения митохондрий. Для начала добавьте 100 milliliters дистиллированной воды в колбу объемом 250 milliliter и интенсивно перемешивайте в течение 20 минут. Чтобы уравновесить воду с атмосферным газом, смочите электрод GRAT несколькими каплями 50% хлорида калия.

Затем поместите небольшой кусочек синей бумаги для самокруток rizla поверх электрода. Затем на бумагу для самокруток положите фрагмент ПТФЭ-мембраны.

Установите внутреннее кольцо с помощью аппликатора для колец, а затем поместите внешнее кольцо в паз электрода. Подключите электроды и соберите основание из большого пластикового кольца, митохондриальную камеру и водяные шланги. Включите блоки GRAT и запустите программное обеспечение GRAS.

Добавьте уравновешенную воду в митохондриальную камеру. Затем поместите магнитный якорь и включите перемешивание. Нажмите на раздел «Оборудование».

Затем включите перемешивание. Установите скорость на 60 и нажмите кнопку подтверждения. После этого начните новый эксперимент.

Нажмите «calibrate» (калибровка), а затем «liquid phase calibration» (калибровка жидкой фазы). Для первого блока установите температуру 37 °C и дважды нажмите «okay». Когда статус «override» изменится на «okay», нажмите на него и откройте баллон с азотом.

Поместите наконечник, подключенный к баллону с азотом, в камеру и создайте бескислородную среду. Нажмите «ОК», когда система переключится из режима ручного управления. Отсосите воду и добавьте 500 µL буфера EB в митохондриальные камеры.

Герметизируйте камеру с помощью плунжера. При использовании нескольких боксов повторите процедуру, начиная с этапа калибровки, для каждого бокса. Запустите новый эксперимент и дайте ему выполняться в течение примерно одной минуты.

Для стабилизации сигнала добавьте необходимый объем суспензии митохондрий, чтобы в каждой камере оказалось 150 micrograms. Отметьте событие и дайте системе поработать. В течение одной минуты добавьте 10 µL теплого раствора 250 millimolar глутамата и 125 millimolar малата для достижения конечной концентрации 5 millimolar глутамата и 2.5 millimolar малата, отметьте это и дайте системе поработать в течение одной минуты.

Это определяется как состояние два. Затем добавьте 7,5 µL 10 mM a DP для достижения конечной концентрации 150 µM. После этого отметьте и дайте системе поработать в течение 30 секунд.

Это определяется как третье состояние. Добавьте еще 7,5 µL 10 мМ ADP и дайте системе работать в течение 1,5 минут. Добавьте 0,5 µL холодного 10 мМ олигомицина для достижения конечной концентрации 1 µM и дайте системе работать в течение трех минут.

Это состояние определяется как состояние четыре. Добавьте 1 µL холодного 0,1 мМ FCCP до конечной концентрации 0,2 µM и подождите три минуты. Это состояние определяется как состояние пять.

По завершении остановите эксперимент и сохраните данные. Определите показатели дыхания с помощью программного обеспечения raft. Введите коэффициент нормализации.

При добавлении 150 мкг митохондриального белка коэффициент нормализации составит 0,15. Рассчитайте нормализованные показатели скорости дыхания для различных состояний дыхания. Рассчитайте коэффициент дыхательного контроля (КДК), разделив показатели состояния три на показатели состояния четыре.

На данном рисунке представлена репрезентативная кривая потребления кислорода митохондриями скелетных мышц. После стабилизации сигнала электрода образец митохондрий добавляют в камеру GRAT. Состояние 2: дыхание начинается после добавления глутамата и малата.

Добавление ADP увеличивает потребление кислорода. Определение состояния 3. Дыхание ATP-синтазы блокируется путем добавления олигомицина для получения дыхания в состоянии 4.

Наконец, добавляют FCCP для разобщения митохондриального дыхания. На данной диаграмме представлены репрезентативные показатели скорости потребления кислорода для состояний 2, 3, 4 и 5. Для каждого эксперимента рассчитывается коэффициент респираторного контроля или RCR.

Значение RCR более четырех считается доказательством жизнеспособности препарата митохондрий. При выполнении данной процедуры важно постоянно хранить образцы митохондрий на льду. После завершения данной процедуры.

Для ответа на дополнительные вопросы, например, о содержании митохондриальных белков, можно использовать другие методы, такие как вестерн-блоттинг. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как изолировать митохондрии из скелетных мышц, а также о дыхании митохондрий.