Определение воздействия на Мутации BRCA1 гомологичной рекомбинации с использованием клеток, которые экспрессируют эндогенного дикого типа BRCA1

Общая цель следующего эксперимента заключается в тестировании специфических вариантов белка BRCA1 с помощью анализа гомологичной рекомбинации in vitro. Это достигается путем замены эндогенного белка BRCA1 дикого типа на тестируемый вариант посредством трансфекции как коротких интерферирующих РНК, специфичных для BRCA1, так и плазмиды для реэкспрессии тестируемых вариантов белков BRCA1 в клетках; на втором этапе короткие интерферирующие РНК и плазмида для экспрессии мутантного BRCA1 вводятся совместно с плазмидой для экспрессии белка I SCE1, который вызывает повреждение ДНК в специфическом сайте генома ДНК тестируемой клетки. Затем клетки инкубируют в течение двух-трех дней, чтобы обеспечить возникновение повреждений и последующее восстановление ДНК; в результате анализа клеток, экспрессирующих GFP, методом проточной цитометрии определяют, функционируют ли конкретные варианты белка BRCA1 в процессе репарации ДНК путем гомологичной рекомбинации.

Данный метод объединяет два общепринятых подхода для создания универсальной системы анализа специфических вариантов белков, участвующих в репарации повреждений ДНК путем гомологичной рекомбинации. Основное преимущество этой методики перед существующими заключается в том, что предыдущие методы опирались на клеточные линии с генетическим нокаутом BRCA1. Мы используем более удобную клеточную линию, производную от клеток HELOC, которая позволяет осуществлять истощение BRC1 с помощью РНК-интерференции эндогенного белка с последующим введением тестового белка в эти клетки.

Теперь, экспрессируя вариант белка BRC one, мы можем протестировать гомологичную рекомбинацию. Как правило, специалисты, впервые использующие данный метод, сталкиваются с трудностями из-за чрезмерной гибели клеток в ходе процедуры. Важно тщательно подобрать условия трансфекции, чтобы максимизировать эффект реакции рекомбинации, ограничив при этом цитотоксичность.

Перед началом данного протокола линия клеток HeLa DR 13 была создана путем трансфекции клеток HeLa плазмидой P-D-R-G-F-P. Поддерживайте клеточную линию в чашках Петри диаметром 10 сантиметров в среде с пуромицином для селекции стабильно трансфицированных клеток. Рекомбинационный субстрат в плазмиде P-D-R-G-F-P и в стабильных трансформантах содержит два неактивных аллеля GFP. Один аллель неактивен из-за включения сайта распознавания рестрикционного фермента IseI длиной 18 пар оснований.

В своей кодирующей последовательности экспрессия I-SceI в этих клетках создает двухцепочечный разрыв ДНК (DSB) во втором аллеле неактивного GFP. Участок его последовательности, соответствующий сайту I-SceI в первом аллеле, является диким типом. Этот второй аллель GFP может функционировать как донор последовательности для гомологичной рекомбинации при репарации DSB, что приведет к образованию активного аллеля GFP, который легко обнаруживается с помощью проточной цитометрии за день до первой трансфекции.

Возьмите чашку диаметром 10 см с клетками HeLa DR 13, конфлюэнтностью не менее 90%. Обработайте клетки трипсином в объеме 1 мл в течение двух-трех минут. Остановите реакцию, добавив 9 мл DMEM-FBS, и тщательно перемешайте клеточную суспензию путем пипетирования. Перенесите по 40 мкл трипсинизированных клеток в каждую лунку 24-луночного планшета в 0,5 мл DMEM-FBS. Инкубируйте клетки при 37 °C и 5% CO2 в течение ночи.

В первый день конфлюэнтность клеток должна составлять от 40 до 50%. Начните трансфекцию, смешав иРНК для истощения эндогенного b RCA one и плазмиду, экспрессирующую мутант B RCA one, в среде Optimum.

Выполните трансфекцию липектомией в соответствии с инструкциями производителя. Верните клетки в инкубатор. Через четыре-шесть часов замените среду на среду, не содержащую антибиотиков.

Верните клетки для инкубации на ночь на второй день. Для трипсинизации клеток добавьте по 0,3 миллилитра реагента TrypLE Trypsin в каждую лунку; после короткой инкубации при 37 °C отсоедините клетки, несколько раз перемещая их пипеткой в реагенте с трипсином. После завершения действия трипсина перенесите клетки из 24-луночного планшета в 6-луночный планшета, содержащий два миллилитра DMEM-FBS, чтобы остановить активность трипсина.

Инкубируйте шестилуночный планшет в течение ночи в тех же условиях, что и ранее, через два дня после первичвой трансфекции. Приготовьте SIR A, плазмидную ДНК, экспрессирующую мутант BRCA1, и плазмиду, экспрессирующую ISCE1, в 62,5 µL Optum. Смешайте этот раствор с 2,5 µL LIPECTOMY 2060 и 2,5 µL Optum.

Приступайте к трансфекции клеток после инкубации в течение четырех-шести часов. Замените среду на D-M-E-M-F-P-S без антибиотиков. Верните клетки в инкубатор на шестой день.

Трипсинизируйте клетки в каждой лунке, добавив 0,5 мл реагента трипсина. Остановите реакцию, добавив два мл DMEM-FBS. Соберите клетки путем центрифугирования при 1000 об/мин в течение пяти минут при комнатной температуре. Ресуспендируйте клетки в одном мл свежего DMEM-FBS и проанализируйте экспрессию GFP для 10 000 клеток в каждой лунке.

Методом проточной цитометрии проводится селекция (гейтирование) одиночных живых клеток с использованием параметров прямого и бокового светорассеяния. GFP-положительные клетки определяются с помощью детектора флуоресценции GFP, и результаты представляются в виде гистограммы. Остальные клетки могут быть повторно высеяны для проведения флуоресцентной микрофотографии.

Микроскопия желаемого BRCA1 регулирует путь репарации двухцепочечных разрывов ДНК посредством гомологичной рекомбинации. Клетки, в которых произошла репарация путем гомологичной рекомбинации, легко обнаруживаются с помощью флуоресцентной микроскопии. Истощение BRCA1 с помощью РНК-интерференции приводит к резкому снижению количества обнаруженных GFP-положительных клеток.

Результатом FCA является гистограмма, где по оси X отложена интенсивность GFP на одну клетку, а по оси Y — количество клеток. В отсутствие трансфекции плазмидой, экспрессирующей GFP, GFP-положительные клетки не обнаруживаются.

Результаты во втором–шестом столбцах были получены из клеток, в которые на третий день была трансфицирована плазмида, экспрессирующая I-SCE1. В типичной серии результатов одного эксперимента 15,5% клеток становятся GFP-положительными после экспрессии I-SCE1 и контрольного РНК-интерференционного подавления нерелевантного гена; для сравнения, подавление BRCA1 и добавление пустого плазмидного вектора снижают конверсию GFP до 0,7%. Добавление экзогенного BRCA1 дикого типа полностью восстанавливает гомологичную рекомбинацию, что подтверждается получением 15–16% GFP-положительных клеток.

Аналогичным образом, экспрессия другого варианта с неопределенным значением полностью восстановила функцию гомологичной рекомбинации, зависящую от BRCA1, при мутации BRCA1 21B. Добавление мутанта BRCA1 M18T оказало эффект, аналогичный контрольному вектору.

Поскольку данный вариант экспрессировался на уровне, схожем с уровнем эндогенного белка, это позволяет предположить, что вариант BRCA1 M18T нефункционален в процессе гомологичной рекомбинации. При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости мониторинга роста клеток; учитывая, что клетки растут медленно и при низкой конфлюэнтности, количество используемой смеси для трансфекции должно быть уменьшено. Также важно своевременно удалить среду для трансфекции.

Мы обнаружили, что в дни после трансфекции наблюдается высокая степень цитотоксичности, если в среду добавлены антибиотики. По этой причине во всех средах после первого дня культивирования антибиотики отсутствуют. Данный метод открыл исследователям в области рака молочной железы возможность изучать генетику вариантов BRC1 с неизвестным клиническим значением в онкологических клиниках.

Мы надеемся, что разработанный в этой работе функциональный анализ BRC one позволит улучшить прогнозирование влияния вариантов BRC one на предрасположенность к раку.