Компьютерный Крупномасштабные визуализации и количественной оценки островков поджелудочной железы Масса, распределении размеров и архитектуры

Общая цель данной процедуры заключается в сборе непредвзятых репрезентативных данных в рамках ограниченной выборки и точном анализе сложной трехмерной структуры ткани. Это достигается путем предварительного получения виртуальных срезов иммуногистохимически окрашенных срезов поджелудочной железы. Затем виртуальные срезы количественно оцениваются с помощью макроса IHC virtual slice в программном обеспечении ImageJ, а полученные данные анализируются с помощью скриптов, написанных для Mathematica.

Затем с помощью Image J выполняется 3D-реконструкция виртуальных срезов. Заключительный этап процедуры заключается в получении стека изображений отдельных островков с помощью программного обеспечения slide book и ручном картировании этих стеков в трех измерениях с использованием stereo investigator. В итоге, благодаря сочетанию методов 3D-визуализации и ручного картирования, можно получить точную архитектуру островков с 3D-координатами для каждой клетки островка. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области изучения ожирения и диабета, например, о том, как физиологические и патофизиологические состояния влияют на массу бета-клеток поджелудочной железы, распределение и архитектуру островков.

Значение данного метода распространяется на диагностику и терапию ожирения и сахарного диабета, поскольку более глубокое понимание изменений массы бета-клеток будет способствовать разработке и оценке терапевтических вмешательств. Хотя методы, описанные в настоящем исследовании, в частности, позволяют детально изучить поджелудочную железу, динамический иммуногистохимический анализ также может быть применен к целому ряду других организмов и тканей. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как этапы компьютерного анализа трудно освоить самостоятельно.

В связи со сложностью анализа таких больших наборов данных в двух и трех измерениях. Начните выполнение данной процедуры, поместив в держатель флуоресцентного микроскопа чистый предметное стекло с целым срезом иммуногистохимически окрашенной поджелудочной железы. Откройте программное обеспечение Stereo Investigator и визуализируйте образец, нажав кнопку «Acquisition» (Сбор данных).

Затем перейдите в режим живого изображения. Определите уровни экспозиции для каждого канала с помощью окна гистограммы видео, в котором отображается интенсивность флуоресценции. В данном примере канал два используется для DAPI, канал три — для GFP, канал четыре — для RFP, канал пять — для sci5, а канал шесть — для SCI7.

В окне настроек камеры отрегулируйте уровень экспозиции так, чтобы интенсивность флуоресценции постепенно снижалась. С помощью колеса фокусировки микроскопа настройте фокус изображения, ориентируясь по правому краю гистограммы видео. Перед созданием виртуального среза определите контур образца, кликнув на экране в точке в стороне от образца, чтобы отметить точку отсчета.

Затем кликайте по контуру образца до полного завершения обводки. После замыкания контура щелкните правой кнопкой мыши и выберите «close contour» (закрыть контур), чтобы соединить начальную и конечную точки. Сделайте виртуальный срез образца, выбрав «acquisition» (сбор данных), а затем «acquire virtual slice» (получить виртуальный срез). В открывшемся окне параметров виртуального среза выберите «high speed acquire» (высокоскоростной сбор) и отключите опцию «manual» (вручную).

Выполните фокусировку, сняв флажок рядом с пунктом manual. Сохраните файл. Отработайте калибровку prefo, щелкнув правой кнопкой мыши и выбрав add to focus site list.

Вручную сфокусируйте несколько случайных участков в предварительном просмотре виртуального среза. После фокусировки нескольких участков запустите создание виртуального среза, щелкнув правой кнопкой мыши и выбрав «Start virtual slice with prefo». После завершения создания виртуального среза для первого образца переключитесь на следующий канал и соответствующим образом отрегулируйте экспозицию. Эту процедуру повторяют для каждого канала для количественной оценки глазков. Обработайте изображения с помощью макроса ImageJ под названием I-H-C-V-S, который сначала подготавливает загруженные изображения к анализу, а затем количественно определяет характеристики глазков, такие как клеточный состав.

Макросы I-H-C-V-S разделяют стек на соответствующие цветовые каналы. В ImageJ каждое изображение преобразуется в восьмибитную черно-белую маску. После автоматического определения порога интенсивности отдельные изображения каналов арифметически суммируются в общую композитную маску.

Встроенный инструмент анализа частиц в Image J применительно к композитному изображению позволит идентифицировать области интереса (ROI), исключая при этом частицы размером меньше одной бета-клетки. Количественный анализ ROI с помощью Image J позволяет сформировать таблицу с параметрами клеток.

Сохраните агрегированные результаты в таблицу Excel. Сохраните такие данные, как площадь, периметр, циркулярность, диаметр Фер и центр каждой люверты, а также соответствующие номера, указанные на изображении. Вычислительный анализ этих параметров может быть выполнен согласно описанному в письменном протоколе. Чтобы получить информацию, включая распределение люверт и частотный анализ, выполните 3D-реконструкцию виртуальных срезов, запустив скрипт, который преобразует все изображения JP2 в каталоге в файлы TIF — формат, используемый при создании и количественном анализе трехмерных стеков из виртуальных срезов.

Здесь используется скрипт под названием I MJ two two tiff. Скопируйте скрипт в директорию, содержащую изображения в формате JP two. Запустите скрипт в оболочке Linux, введя в консоли dot slash I am JP two two TIFF и нажав клавишу enter.

Когда все полученные изображения будут преобразованы из файлов JPEG в TIFF, они будут готовы к анализу в программе ImageJ. С помощью ImageJ откройте все изображения первого образца (в данном случае это поджелудочная железа плода человека) и объедините их в одно, выбрав Image, затем Color и Merge Channels. Повторите этот процесс для каждого образца, пока все образцы не будут объединены в единые изображения. Очистите изображения, выделяя ненужные области с помощью инструмента Polygon Selections.

Заполните их, выбрав «edit», а затем «fill». Преобразуйте каждое изображение в RGB-цветное изображение. В завершение создайте стек из этих изображений, после чего их можно будет дополнительно выровнять с помощью плагина stack reg.

В конечном итоге объединение каналов и совмещение изображений позволяет создать 3D-монтаж всех островков в пределах всей поджелудочной железы. Для сбора стеков изображений поместите препарат поджелудочной железы с островками под микроскоп. При использовании объектива с имерсией в воду добавьте воду.

Откройте программное обеспечение slide book, перейдите к управлению захватом изображения и фокусировкой, нажав Ctrl+Shift+E в окне управления фокусировкой. Установите объектив с увеличением 20x или 40x в зависимости от размера глазка. Чтобы найти глазки с помощью окуляра микроскопа, установите значение bin на 2x, а набор фильтров — на user 1.

В окне управления фокусом установите выбор эмиссии на 100%Eyes, нейтральный фильтр — на один щелчок GFP ey, затем откройте затвор, чтобы визуализировать образец в slide book, вернитесь в окно управления фокусом и переключите набор фильтров на fix. Затем нажмите G-F-P-D-S. С помощью джойстика максимально точно центрируйте глазную линзу в окне camera one.

Сфокусируйтесь на глубине примерно в центре отверстия, где клетки хорошо различимы. В окне управления фокусом выберите zab. Используя управление микроскопом, прокрутите до максимально верхней глубины отверстия, при которой признаки четко различимы, и нажмите «set top».

Прокрутите до нижней части списка и нажмите «set». Нажмите «go» внизу. Чтобы вернуться к опорной точке в окне захвата, нажмите «advanced», а затем выберите «alternate to channel mode».

В правой части окна установите коэффициент биннинга (bin factor) на значение 2, а тип захвата — на 3D; выберите опции «использовать верхнее и нижнее положения» (use top and bottom positions) и «возврат к центральному объему после захвата» (return to center volume after capture). Установите размер шага на три. В поле набора фильтров выберите режим «в реальном времени» (live).

Выберите DAP, E-D-S-U-G-F-P-D-S-U-R-F-P-D-S-U и пять DSU в SCI. Для каждого из них нажмите «find best» в меню «adjust exposure». Затем нажмите «test», чтобы убедиться, что выбранная экспозиция подходит.

Нажмите «start», чтобы начать захват изображения. После завершения захвата при необходимости отрегулируйте уровни и измените отображаемый цвет для RFP на белый. Сохраните слайд и перейдите в раздел «view export TIFF series».

Введите название препарата, добавив в конце дефис, и сохраните его. Будут созданы десятки отдельных TIF-файлов, поэтому для удобства рекомендуется хранить стек изображений каждой люверки в отдельной папке. Для сопоставления стеков изображений откройте программное обеспечение Stereo Investigator.

Визуализируйте изображение, открыв стеки изображений в меню масштабирования изображений. Установите расстояние между изображениями 3 µm, чтобы скорректировать двукратный изгиб. В книге слайдов выберите опцию переопределения масштабирования по X и Y и укажите значения для источников масштабирования по X и Y.

Введите 0,65 для координат X и Y центра, увеличьте изображение, нажав кнопку масштабирования, а затем в центре интересующей области в макроокне отметьте как минимум одну клетку. При использовании соответствующего маркера бета-клетки будут окрашены в зеленый цвет, альфа-клетки — в красный, а дельта-клетки — в белый.

Отметьте клетки в центре их ядер, которые будут окрашены в синий цвет, если образец был окрашен DPI. Используйте Маркер 2 для отметки бета-клеток, Маркер 5 для отметки альфа-клеток и Маркер 6 для отметки дельта-клеток. После того как будет отмечена хотя бы одна клетка, включите ортогональный вид с помощью иконки в верхнем меню, установите флажки Z-фильтра и симметричного отображения.

Диапазон должен быть установлен на 15.00. Начните с позиции 0.0 по оси Z. Прокручивайте отверстия с помощью колеса мыши и отмечайте каждую клетку соответствующим маркером; каждую клетку следует отметить только один раз в центре её глубины. После завершения разметки всех уровней Z флажок Z-фильтра можно снять.

В этом режиме будут отображены все маркеры для всех уровней Z. После того как будут отмечены все клетки, сохраните файл в формате DAT. Затем перейдите в меню File → Export Tracing.

Сохраните трассировку в виде TXT-файла. Наконец, нажмите «new data file», чтобы очистить рабочую область перед попыткой картирования новых островков. Подготовка виртуальных срезов из образца поджелудочной железы, окрашенного иммуногистохимическим методом, позволяет исследовать альфа-, бета- и дельта-эндокринные клетки во всей поджелудочной железе совместно в виде островков; иммуногистохимическое окрашивание на инсулин отображается зеленым цветом, на глюкагон — красным, на соматостатин — белым, а на DAP — синим.

Затем изображения были преобразованы в восьмибитные маски после автоматической пороговой обработки. Здесь представлено совмещенное композитное изображение. Однако распределение люверсов с использованием виртуальных срезов также позволяет проводить индивидуальный анализ в отдельных каналах.

Здесь представлены изображения каждого канала, позволяющие визуализировать дельта-клетки, бета-клетки и альфа-клетки. Анализ частиц был проведен на основе композитной маски, где каждая структура островка пронумерована и выделена синим цветом. Результатом анализа частиц на композитных масках является таблица данных, содержащая такие параметры, как площадь, периметр, циркулярность и различные диаметры для каждого обнаруженного островка, идентификаторы которых соответствуют номерам меток на композитной маске.

Крупномасштабный анализ этих изображений позволяет построить гистограммы общего количества и распределения размеров островков, а также провести детальное сравнение площадей альфа-, бета- и дельта-клеток. Картирование островков и математический анализ клеточного состава и архитектуры позволяют выделить одну фокальную плоскость из стека 3D-реконструированных изображений островков человека, загруженных в программу Stereo Investigator. Здесь бета-клетки отмечены зеленым, альфа-клетки — красным, дельта-клетки — белым цветом, а ядра — синим.

После захвата отдельных глазков (eyelets) здесь на различных уровнях сечения отмечены альфа-, бета- и дельта-клетки; представлены флуоресцентные изображения и соответствующие карты данных для трех различных фокальных плоскостей с интервалом 10 microns. После того как альфа-, бета- и дельта-клетки были отмечены на разных плоскостях, глазок можно визуализировать в 3D. Здесь представлена 3D-реконструкция четверти разрезанного глазка на основе координат, полученных при картировании глазков.

Кроме того, автоматизированный математический анализ картированных микроотверстий позволяет определить клеточный состав и архитектуру. Здесь представлена относительная частота расстояний между клетками внутри одной популяции клеток. Также показана относительная частота расстояний между клетками из двух различных популяций.

Также представлены кумулятивные вероятности распределения расстояний между клетками для пар альфа-альфа, бета-бета и дельта-дельта. Для получения соответствующих расстояний KS к этим вероятностям может быть применен критерий Колмогорова-Смирнова или KS-тест. После освоения метода визуализация и анализ всего среза ткани в большом масштабе могут быть выполнены за четыре часа.

3D-реконструкция блока ткани может быть выполнена за 30 минут. В конечном итоге 3D-визуализация и ручное картирование могут быть завершены за четыре часа при условии правильного выполнения. При проведении данной процедуры важно начать с высококачественного иммуногистохимического окрашивания срезов.

Точность последующего анализа будет полностью зависеть от необработанных данных. Также убедитесь, что ваши компьютеры имеют как минимум восемь гигабайт оперативной памяти для обработки такого крупномасштабного анализа. После своей разработки этот метод открыл возможности для исследователей не только в области изучения ожирения и диабета, но и во многих других областях, использующих стандартный патологоанатомический анализ.

Это может быть особенно полезно при ограниченном количестве доступных образцов. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как с помощью стандартных методов собирать объективные репрезентативные данные при ограниченном размере выборки. Выбор только определенной области может не дать полного представления о картине в целом, что мы продемонстрировали в нашем исследовании распределения островков поджелудочной железы.