Аналитический инструмент коробки комплексных биохимические, структурные и транскриптома Оценка устного Биопленки посредничестве Mutans стрептококков

Биопленки, образующиеся на поверхности зубов, обладают высокой степенью сложности и структурированности. Это микробные сообщества, заключенные в экстрацеллюлярный матрикс и подвергающиеся постоянному воздействию факторов окружающей среды. Основная цель данной работы — продемонстрировать два конкретных компонента аналитического инструментария, разработанного для облегчения структурных и молекулярных исследований с учетом сложной природы оральных биопленок путем сочетания нового метода флуоресцентной визуализации с специализированным программным обеспечением для обработки и анализа данных.

Это достигается путем первоначального выбора специфических методов анализа биопленок, транскриптома и структуры, включая новый подход к конфокальной визуализации для одновременного отображения EPS и бактерий. Вторым этапом процедуры является сбор необработанных данных из биоанализов. Третьим этапом является обработка необработанных данных с помощью специализированного программного обеспечения, включая недавно разработанный инструмент duo stat для анализа колокализации.

Заключительным этапом является анализ данных процесса, включая использование программного обеспечения для организации и интеллектуального анализа данных микрочипов Microarray Data Visualizer (MDV). В конечном итоге с помощью нашего уникального интегрированного набора аналитических инструментов можно получить результаты, демонстрирующие, как оральные патогены изменяют свой транскриптом и архитектуру биопленок в ответ на комплексную диету и микробные взаимодействия с хозяином, что обеспечивает более всесторонний анализ биопленок и интерпретацию данных. Здравствуйте, меня зовут Мишель Ку, я доцент Центра биологии полости рта в Медицинском центре Университета Рочестера.

Сегодня мы представляем аналитический инструментарий для анализа биопленок. Этот набор инструментов поможет ответить на ключевые вопросы в области исследования биопленок, такие как структура клеток биопленки, их взаимодействие с внеклеточным матриксом и их реакция на сложные вызовы окружающей среды на транскриптомном уровне. Меня зовут Жан, я постдок в лаборатории доктора Кса.

Сегодня я продемонстрирую часть нашего инструментария, посвященную визуализации. Здравствуйте, меня зовут Айзе Кляйн. Я старший научный сотрудник в лаборатории доктора Кс.

Сегодня я представлю программное обеспечение MDV для анализа данных микромассивов. В данной процедуре в качестве заменителей поверхности зуба используются диски из гидроксиапатита, покрытые слюной, на которых выращивают биопленки. Сначала добавьте в каждую лунку планшета на 24 лунки по 2.8 milliliters питательной среды, инокулированной S. mutants, оберегая планшет от света; затем добавьте в каждую лунку краситель LOR 6 47, конъюгированный с декстрином, до конечной концентрации 1 micromolar и несколько раз перемешайте краситель с питательной средой с помощью пипетки.

Затем, используя стерильный пинцет, дважды промойте стерильные диски из гидроксиапатита, покрытые слюной, в стерильном буфере AB, чтобы удалить излишки слюны или несвязанные компоненты слюны. Затем разместите диски вертикально в культуральной среде с добавлением красителя, убедившись, что каждый диск полностью погружен. Накройте планшет алюминиевой фольгой и инкубируйте при 37 °C в инкубаторе с 5% carbon dioxide в течение 20 часов, чтобы обеспечить формирование биопленок и включение конъюгированного красителя в экзополисахариды, вырабатываемые бактериальными клетками.

Для предварительного окрашивания бактериальных клеток подготовьте 24-луночный планшет, налив в каждую лунку по 2,8 миллилитра стерильной воды Milli-Q. Добавьте в каждую лунку 1,5 микролитра красителя CytoNine до конечной концентрации 1 мкМ и защитите планшет от света. После формирования биопленки извлеките планшет с дисками из инкубатора.

Промойте каждый диск в 0,89% растворе хлорида натрия. Затем перенесите их на новую планшетку с красителем Cyto Nine. Накройте планшетку алюминиевой фольгой и инкубируйте в течение 30 минут при комнатной температуре.

После окрашивания клеток погрузите биопленки в раствор хлорида натрия и промойте их, как описано ранее. Затем с помощью пинцета перенесите биопленки с проволоки в чашку Петри с хлоридом натрия. Оберните чашку Петри алюминиевой фольгой.

Теперь биопленки готовы к визуализации методом конфокальной микроскопии с использованием лазерного сканирующего конфокального микроскопа. Просканируйте каждую биопленку в пяти–десяти случайно выбранных точках, создавая в каждой из них Z-стек. Для проведения 3D-реконструкции откройте конфокальные изображения и обработайте их с помощью специализированного программного обеспечения.

Эта трехмерная визуализация конфокальных изображений, созданная с помощью программы Amira, демонстрирует биопленку S-мутантов, сформированную на апатитовой поверхности с использованием описанной процедуры. Бактериальные клетки и микроколонии выделены зеленым цветом и погружены в матрикс биопленки, содержащий экзополисахариды. Красным цветом может быть выделен увеличенный вид выбранной области, иллюстрирующий специфическую структурную взаимосвязь между бактериями и ЭПС на микроуровне.

Используйте программу duos stat для количественного определения степени колокализации отдельных компонентов биопленки, таких как бактерии и экзополисахариды. Сначала настройте путь к недавно разработанному модулю duo stat в MATLAB версии 5.1 и откройте папки с изображениями, содержащие Z-серии снимков двух компонентов биопленки. Затем выберите два канала, которые будут подвергнуты корреляционному анализу.

Два стека изображений должны иметь идентичный размер пикселей по всем измерениям и одинаковое количество изображений в каждом стеке. Установите пороги для каждого канала, следуйте инструкциям в интерфейсе программного обеспечения и введите данные в файл обработки данных для анализа. На этом рисунке показано, как duo stack количественно интерпретирует пространственную связь между бактериями и DBS.

В пределах биопленки программа Duo stack рассчитывает вертикальное распределение бактерий и ВПС от поверхности диска до жидкой фазы, что представлено здесь зеленой линией для бактерий и красной линией для ВПС. Она также рассчитывает колокализацию бактерий и ВПС по всей толщине биопленки. Как видно по желтой линии, данные демонстрируют более высокую пропорцию ВПС по сравнению с бактериями на всей глубине биопленки, и большинство бактериальных клеток связаны с ВПС, особенно начиная со средних слоев и выше. Duo stat с 3D-визуализацией обеспечивает более глубокое понимание структурной организации и взаимодействия бактерий и ВПС в биопленках.

Для получения высококачественной РНК из биопленок мы рекомендуем проводить экстракцию РНК в соответствии со специфическим протоколом для биопленок, описанным в статье Curian KU, опубликованной в 2007 году. В журнале Analytical Biochemistry используются стандартные протоколы для подготовки микрочипов cDNA и проведения количественного ПЦР в реальном времени. Чтобы облегчить анализ больших наборов данных, полученных в ходе экспериментов с микрочипами, мы разработали программное обеспечение для организации и интеллектуального анализа данных — визуализатор данных микрочипов (microarray data visualizer) или MDV, которое доступно онлайн по адресу www.oralgen.anl.gov.

Перед отправкой данных в MDV проведите статистический анализ, например, парный T-критерий с моделью случайной дисперсии, используя онлайн-программное обеспечение BRB array tool с пороговым значением P = 0.001 для сравнения классов. В данном примере был проведен анализ биопленок S. mutans, выращенных при трех различных концентрациях сахаров в четыре временные точки. Попарные сравнения были выполнены с созданием трех файлов BRB: условие A (0,5% сахарозы плюс 1% крахмала против 1% сахарозы), условие B (0,5% сахарозы плюс 1% крахмала против 0,5% сахарозы) и условие C (0,5% сахарозы против 1% сахарозы).

На этой панели представлено количество генов, определенных как дифференциально экспрессируемые в каждом состоянии и временной точке, оцененных с помощью стандартного сравнения классов с использованием инструмента BRB array, что приводит к получению большого количества генов, именуемых «сырыми данными BRB». Для демонстрации MDV мы сосредоточимся на временной точке 30 часов, используя Excel. Преобразуйте сырые данные BRB в текстовые файлы MDV с разделителями-табуляторами.

Обязательно удалите все буквы, которые следуют за номером локуса гена; например, в названии SMU dot 1432 C удалите букву C. Откройте MDV. Откройте меню «File» (Файл) и выберите «Select annotation source» (Выбрать источник аннотации). Когда появится диалоговое окно, выберите вариант «Flat file» (Плоский файл).

Используйте кнопки обзора для выбора файлов, содержащих аннотации для данных функциональной классификации путей по номерам онтологии генов и названий генов. Перейдите в меню «Файл» (File) и импортируйте каждый из файлов, конвертированных в формат MDV. Каждый файл соответствует определенному экспериментальному условию.

Сравните гены, экспрессируемые в каждом экспериментальном условии A, B и C. В данном примере используется функция диаграммы Венна. В этой демонстрации мы сосредоточимся на дифференциально экспрессируемых генах, которые уникально связаны с совместным воздействием сахарозы и крахмала. Функция на основе диаграммы Венна используется для визуализации количества уникальных и общих генов, экспрессируемых при этих различных условиях, и помогает нам определить гены, которые будут отобраны для дальнейшего анализа.

Здесь мы выбираем только те дифференциально экспрессируемые гены, которые уникальны для условия A и/или B, но не те, которые были обнаружены в C (выделены серым цветом, как показано здесь). MDV значительно сократил общее количество анализируемых генов и одновременно отфильтровал гены, не имеющие отношения к данному экспериментальному случаю. В меню «Файл» выберите опцию экспорта для сохранения данных.

Поскольку файлы имеют разделитель в виде табуляции, их можно открыть в Excel, где выходные данные можно организовать и преобразовать в необходимые графические представления. Организация данных в Excel позволяет визуализировать результаты MDV. На данном графике представлен обзор дифференциальной экспрессии уникальных функциональных подмножеств генов, на которые влияет сочетание крахмала и сахарозы на разных стадиях развития биопленки.

Влияние на транскриптом мутантов S более выражено через 30 часов развития биопленки, чем в другие временные точки. Полученные данные помогли нам точно определить специфические функциональные подмножества генов, имеющие значение для нашей рабочей гипотезы, с учетом временных эффектов, которые облегчили процесс отбора генов и их последующей валидации. После выполнения данной процедуры также могут быть применены биохимические и протеомные методы для поиска ответов на дополнительные вопросы, например, о специфических физиологических и метаболических реакциях организмов внутри биопленок.

Столь всесторонний и комплексный анализ определенно поможет глубже понять, как биопленки модулируют патогенность в полости носоглотки — крайне динамичной и сложной среде. Для получения более подробной информации, пожалуйста, ознакомьтесь с PDF-файлом, прикрепленным к данной видеостатье.