Улучшенная Визуализация и количественный анализ на наркотики эффекты с помощью Micropatterned Клетки

Общая цель данной процедуры — продемонстрировать, как нормализация архитектуры и положения клеток, достигнутая на специфических адгезивных микропаттернах, позволяет легко автоматизировать сбор изображений и упростить их обработку с чувствительной и надежной количественной оценкой эффектов препаратов, что недостижимо на обычных стеклянных покровных стеклах. Это реализуется путем посева клеток heli на чипы SI two, содержащие L-образные микропаттерны, помеченные SI three. Клетки принимают треугольную форму, формируя основной стресс-фибриллярный тяж, соединяющий два конца L-образной фигуры. Затем клетки на паттернах инкубируют с lebos statin или оставляют без обработки, после чего фиксируют и окрашивают для визуализации актинового цитоскелета и ядер.

Затем получают изображения клеток в микропаттернах и обрабатывают их с помощью макроса cell ref для создания стека изображений для анализа и макроса hypotenuse для количественной оценки фенотипов. В итоге можно получить результаты, демонстрирующие значительный эффект низких доз статинов BLE на клетки HELOC в микропаттернах, который не обнаруживается в стандартных условиях культивирования клеток. Здравствуйте, добро пожаловать.

Сегодня мы ознакомим вас с нашим экспериментальным протоколом, в котором объясняется способ использования адгезивных микропаттернов для анализа клеток, а также продемонстрируем экспериментальные данные, иллюстрирующие простоту количественного определения очень низких доз препаратов на таких адгезивных микропаттернах. При первом знакомстве с этими микропаттернами вы сразу поймете, как они позволяют решить проблему вариативности при захвате изображений во время анализа клеток. Поскольку наличие упорядоченного массива клеток, подобного микрочипу, позволяет легко перемещать предметный столик микроскопа от одной клетки к другой для пошагового получения изображений.

Но, конечно, это не единственное преимущество, которое дают микропаттерны. Они обеспечивают гораздо больше улучшений, поскольку на определенных типичных микропаттернах, таких как крестообразный или Y-образный, мы фактически нормализуем внутреннюю архитектуру клеток. Это означает, что органеллы, веретено деления, цитоскелет и различные белковые сети располагаются в одних и тех же местах или имеют одинаковую ориентацию от клетки к клетке, что значительно облегчает прогнозирование и количественную оценку воздействия препаратов на эти конкретные структуры. На первый взгляд это может показаться довольно контринтуитивным по сравнению с тем, как обычно проводят эксперименты в классической чашке Петри или микропланшете.

Ну, поскольку вы часто видите, конечно, как клетки перемещаются и приобретают различную морфологию. В то время как на адгезивных микропаттернах все клетки начнут выглядеть одинаково, потому что они реагируют на этот адгезивный микропаттерн и организуют свою архитектуру одинаковым образом. Это может показаться, по сути, немного искусственным, но если присмотреться, разве чашка Петри не еще более искусственна?

Поскольку в тканях клетки ограничены соседними клетками, а также внеклеточным матриксом, они получают значительный объем пространственной информации, которая определяет архитектуру клетки. Именно для этого мы используем микропаттерны.

Мы восстанавливаем эту пространственную информацию в клетках, и все клетки реагируют на это, организуясь одинаковым образом. Поскольку теперь все клетки выглядят одинаково, мы можем ввести понятие референсной клетки; это означает, что мы можем усреднить все изображения и получить одно изображение, которое действительно репрезентативно отображает вид клетки в данных условиях. Затем можно добавить препарат, снова изучить эту референсную клетку и увидеть, как изменилась морфология или организация клетки в ответ на воздействие этого препарата.

Поместите по одному чипу situ two в две отдельные лунки планшета на шесть лунок, убедившись, что логотип situ two читаем. Чипы situ two, используемые в данном эксперименте, имеют микропаттерны, окрашенные FibroGen SI three, и до использования должны храниться в темноте. Соберите клетки hela с конфлюэнтностью примерно 80% с помощью трипсина и под микроскопом убедитесь, что они полностью отделены друг от друга; центрифугируйте при 300 G в течение четырех минут и аккуратно ресуспендируйте клетки, затем подсчитайте их и разведите до концентрации 15 000 клеток на миллилитр.

В лунки с неполной культуральной средой D-M-E-M-F 12 внесите по 60 000 клеток в каждую. Пластину следует перемещать как можно меньше, чтобы избежать возникновения вращательных движений среды, которые приведут к концентрации клеток в центре. Дайте клеткам осесть в течение 10 минут под вытяжным шкафом, затем перенесите их в клеточный инкубатор.

Через 10–20 минут в клеточном инкубаторе клетки начнут прикрепляться; спустя 10 минут регулярно проверяйте под микроскопом, прикрепились ли клетки. Замените клеточную среду и удалите излишки клеток, повторив следующую процедуру четыре раза. Держа планшет в горизонтальном положении, осторожно аспирируйте среду с края лунки.

Следите за тем, чтобы в чипе оставалось достаточное количество среды, чтобы предотвратить его пересыхание. Добавьте 4 мл PBS и произведите аспирацию, начиная с центра чипа. Затем переместитесь к краю лунки, чтобы аспирировать большую часть PBS, как и ранее, и проверьте под микроскопом наличие плавающих клеток.

Если остается большое количество плавающих клеток, повторите процедуру промывки. Если клеток очень мало, аспирируйте часть PBS и замените ее двумя миллилитрами свежей среды, повторив эту операцию дважды, добавив по четыре миллилитра свежей среды. Инкубируйте клетки в течение трех часов в клеточном инкубаторе, чтобы они полностью распластались.

При использовании данного метода от 10 до 30% микропаттернов будут заняты одной клеткой, в то время как остальные паттерны останутся либо пустыми, либо будут заняты несколькими клетками. Для обработки клеток BLEs statin разведите стоковый раствор препарата с концентрацией 17 mM до конечной концентрации 5 µM, используя 0,1% DMSO в четырех миллилитрах среды. Для контроля приготовьте среду, содержащую только 0,1% DMSO. Аспирируйте среду с клетками и быстро замените ее растворами BLEs statin или контрольными растворами, чтобы предотвратить высыхание чипа.

Инкубируйте клетки в течение одного часа при 37 °C. Во время инкубации приготовьте буфер для цитоскелета. Добавьте 1 г сахарозы в 2 мл cb.

Это помогает сохранить внутренние структуры клеток. Смешайте 1 mL сахарозы в CB-буфере с 4 mL 5% PFA. Добавьте 2 mL раствора PFA в CB-буфере с сахарозой.

В две лунки новой шестилуночной планшета. Для фиксации клеток с помощью пинцета возьмите чип CY two и поместите его в шестилуночный планшет, содержащий 2 mL PFA в растворе CB sucrose. Инкубируйте клетки в течение 10 минут при комнатной температуре, удалите PFA и один раз промойте клетки PBS, затем промойте клетки 2 mL 100 mM хлорида аммония в течение 10 минут.

Для подавления остаточной сшивающей активности ПФА пермеабилизируйте клетки, добавив два миллилитра PBS, содержащего 0,1% Triton X 100, на три минуты; дважды промойте PBS. Окрасьте актиновые филаменты двумя миллилитрами конъюгата ZI с фаллоидином в разведении 1:2000 в PBS с 1,5% BSA, инкубируйте в течение одного часа при комнатной температуре. Затем один раз промойте клетки двумя миллилитрами PBS. Далее окрасьте ядра.

Добавьте 2 mL раствора hawked в PBS в концентрации 1 mg/mL и инкубируйте в течение 3 минут при комнатной температуре. Дважды промойте 2 mL PBS. Закрепите два чипа на стандартном предметном стекле, используя 25–30 µL фиксирующего раствора, такого как al.

Для получения изображений на трех длинах волн мы используем программное обеспечение для визуализации Metamorph и микроскоп NIK icon eclipse T, оснащенный CCD-камерой Hema Matsu и волоконным ртутным осветителем intens lite. Сначала выберите 20-кратное увеличение.

Затем в строке меню откройте раздел многомерного сбора данных (multidimensional acquisition), чтобы настроить параметры эксперимента. Сначала укажите путь для сохранения данных.

Установите количество длин волн равным трем, выберите стандарт SI для трех длин волн и расположите предметное стекло с покровным стеклом так, чтобы 12 микропаттернов находились в центре поля зрения камеры. Количество микропаттернов, видимых в одном поле, будет варьироваться в зависимости от настроек камеры и объектива. Установите время экспозиции для каждой длины волны и выполните автоматическую фокусировку.

Для PS three создайте журнал многомерного сбора данных и сохраните его как MDA jnl. Откройте функцию сканирования столика для получения 24 изображений, каждое из которых содержит 12 микропаттернов. Введите шесть столбцов и четыре строки с шагом по оси x минус 400 micron и шагом по оси y 300 micron в наборе журналов для выполнения, загрузите журнал MDA jnl и нажмите scan, чтобы запустить автоматический сбор 24 изображений на трех длинах волн.

В данном видео используются микроузоры в форме буквы L для инициации формирования одного основного актинового стресс-волокна, которое поддерживает незакрепленную часть клетки; это упрощает визуализацию и измерение влияния статинов на BLE по сравнению с клетками, расположенными на однородном слое фибронектина. Для автоматизированной обработки и анализа изображений мы описываем два специально разработанных макроса для программы с открытым исходным кодом ImageJ: первый макрос извлекает отдельные клетки из стека необработанных изображений и создает эталонную клетку, а второй макрос измеряет степень коллапса клеточной мембраны.

Первым этапом является сегментация отдельных клеток на исходных изображениях. Изображения с флуоресцентно мечеными микропаттернами используются для выделения областей, центрированных по микропаттернам; эти области обрезаются на изображениях для каждой длины волны и объединяются в стеки для каждой длины волны. Для выбора микропаттернов с одиночными клетками макрос определяет количество ядер на изображении и удаляет из всех стеков те, которые содержат либо более одного ядра, либо не содержат ядер вовсе.

Наконец, плагин Multi-Stack Reg для ImageJ используется для повторного выравнивания всех полученных изображений и всех каналов по положению микропаттерна. На этом этапе создаются стеки строк из отдельных изображений, которые теперь можно использовать для анализа одиночных клеток или для создания эталонной клетки. В ImageJ эталонная клетка создается путем построения проекции отфильтрованных и выровненных изображений из стека.

Можно применять несколько методов проекции, но обычно выбирают медианную проекцию, чтобы устранить выбросы в стеке изображений. Контрольная клетка представляет собой уникальный и полезный инструмент для визуализации и анализа изображений, который можно получить только при использовании микропаттернированных клеток. Для облегчения анализа применяется таблица поиска (LUT), которая преобразует монохромное изображение в кодированную карту частот.

Для характеристики эффекта статинов на BLE была проанализированы жесткость и коллапс клеток с помощью второго макроса Image J. Вкратце, пороговые изображения L-микропаттерна используются для определения теоретического гипотенузы треугольной формы клетки. Затем выполняется пороговая обработка изображений окрашивания актина для определения формы клетки.

Затем измеряется разница в площади между теоретической гипотенузой и фактической вогнутой клеточной мембраной; клетки, площадь которых находится ниже теоретической гипотенузы, считаются коллапсировавшими. Влияние 5 µM BLEs statin оценивали путем сравнения количества коллапсировавших клеток в опытной и контрольной группах. На представленных типичных изображениях показаны клетки в L-микропаттернах, обработанные BLEs statin или оставленные без обработки; клетки были зафиксированы и окрашены в микропаттернах.

Актин и ядра показаны красным, зеленым и синим цветом соответственно. Обратите внимание на влияние статина BLEs на форму клеток по сравнению с контрольными условиями. Здесь представлены репрезентативные клетки после инкубации со статином BLEs или контролем на обычном фибронектине.

Клетки были фиксированы и окрашены; актин и ядра обозначены зеленым и синим цветами соответственно. Обратите внимание на сходство между опытными и контрольными условиями. Представлены типичные изображения контрольных клеток, полученные от клеток, обработанных статином BLEs, или необработанных клеток.

Обратите внимание на потенциал данного подхода для облегченного наблюдения за изучаемым фенотипом. Ниже приведен пример анализа воздействия статина BLEs на клетки с использованием макрогипотенузы. В то время как 25% контрольных клеток были коллапсированы, в клетках, обработанных статином BLEs в концентрации 5 µM, этот показатель увеличился в три раза до 75%, что отражает ослабление сократительной сети актинина.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как адгезивные микропаттерны позволяют устранить ряд проблем при высокопроизводительном анализе. Во-первых, использование адгезивных микропаттернов значительно упростило процесс захвата и анализа изображений. Во-вторых, микропаттерны позволяют обнаруживать очень слабые эффекты препаратов в крайне низких дозах, поскольку они снижают вариабельность между клетками за счет нормализации их морфологии и поведения.

И наконец, по сравнению с тысячами клеток, которые обычно необходимы для получения достоверного результата при анализе клеток, при использовании нашей референтной клетки для получения надежного и значимого результата достаточно всего нескольких десятков клеток.