Сбор переменной концентрации Изотермические наборов калориметрия титрования с целью определения обязательных механизмов

Общая цель данной процедуры заключается в подборе подходящей физической модели, описывающей связывание макромолекулы с её лигандом, и определении соответствующих термодинамических параметров. Для этого сначала готовится стоковый раствор макромолекулы с помощью тщательного диализа. Затем интересующий лиганд растворяют в конечном диализном буфере, после чего на втором этапе определяют концентрации всех компонентов.

Образцы макромолекулы и лиганда тщательно разводят до ряда различных концентраций. Затем проводится серия экспериментов по изотермической титрационной калориметрии (ИТК) при нескольких концентрациях лиганда и белка, чтобы на заключительном этапе процедуры получить серию изотерм ИТК. Выполняется глобальный анализ серии экспериментов с использованием различных физических моделей, и модель, обеспечивающая наилучшее общее соответствие, определяется как верная.

Сегодня я продемонстрирую метод, который помогает ответить на биофизические вопросы, например, о том, как молекулы белков связываются со своими лигандами, а также позволяет точно измерить такие параметры связывания, как энтропия, энтальпия и константы ассоциации. Перед началом данного протокола необходимо очистить интересующий вас белок; в данной демонстрации в качестве макромолекулы используется immuno GLYCOSIDE N six prime, a subtle transferase one I или a C six prime one I. Для начала приготовьте четыре литра диализного буфера и охладите его до 4 °C. Затем проведите диализ небольшого объема раствора макромолекулы.

В данном случае пять миллилитров 400 мкМ AAC C six prime, one eye помещают в 1,3 литра диализного буфера при температуре четыре °C. Это можно сделать в холодном помещении или в холодильнике; замену на свежий буфер следует проводить каждые восемь часов, выполнив диализ в общей сложности три раза. Сохраните конечный диализный раствор.

Профильтруйте 750 миллилитров конечного диализного раствора через целлюлозный фильтр с порами 0.45 мкм и храните при температуре четырех градусов Цельсия. Этот буфер, который далее будет именоваться рабочим буфером, будет использоваться для промывки и в качестве разбавителя. Для подготовки образцов тщательно промойте шприцевой фильтр с порами 0.2 мкм рабочим буфером.

Нанесите образец белка и отфильтруйте его. Осторожно соберите образец в коническую пробирку перед хранением белкового раствора, затем определите концентрацию белка с помощью стандартного метода анализа белков. В данном случае концентрация белка измеряется по ABSORBENCE при 280 нанометрах, после чего рассчитывается концентрация фермента.

Используя коэффициент экстинкции, полученный с помощью протеомного сервера EXI, сохраните белок таким образом, чтобы максимально обеспечить его долгосрочную стабильность. AAC C six prime one eye следует хранить при температуре 4 °C, так как он теряет активность после замораживания и оттаивания. Затем растворите лиганд и рабочий буфер. Для данной демонстрации 4 mg ацетил-коэнзима А растворили в 200 µL рабочего буфера для приготовления стокового раствора с концентрацией 25 mM.

Этот лиганд можно хранить при температуре -78 °C до начала подготовки образцов для ITC. Сначала рассчитайте концентрацию фермента, чтобы получить значение C, равное 64, как описано в письменном протоколе для AAC 6' 1. Это соответствует концентрации 192 µM. Приготовьте 2 мл раствора макромолекулы с такой концентрацией, разбавляя стоковый раствор фильтрованным рабочим буфером. Разморозьте раствор ацеталь-коэнзима А в ледяной водяной бане. После размораживания раствора ацеталь-коэнзима А осторожно перемешайте его. Рассчитайте концентрацию раствора лиганда, умножив концентрацию макромолекулы на количество центров связывания и затем на 10.

Приготовьте раствор ацетил-кофермента А, добавив 80 µL стокового раствора 25 мМ ацетил-кофермента А к 420 µL рабочего буфера и перемешав. Перенесите разбавленный раствор ацетил-кофермента А в трубку для заполнения пипетки, а оставшийся стоковый раствор 25 мМ верните при температуре -78 °C для хранения. Дегазируйте растворы AC6'1I и ацетил-кофермента А под вакуумом в течение пяти минут при 19 °C, что на 1 °C ниже требуемой рабочей температуры эксперимента.

Для подготовки шприца для инъекций вставьте его в держатель шприца до тех пор, пока предварительно установленный зажим для шприца не окажется на одном уровне с держателем. Надвиньте второй зажим для шприца на шприц для инъекций до тех пор, пока он плотно не прижмется к основанию держателя шприца. Осторожно затяните зажим с помощью прилагаемого шестигранного шарикового ключа 0.05 inch.

Затем установите держатель шприца в держатель пипетки. Осторожно вставьте инжектор пипетки в инъекционный шприц, убедившись, что наконечник поршня входит точно в отверстие шприца. После полной установки закрутите стопорное кольцо держателя шприца в инжекторе пипетки.

Перед нанесением раствора белка A a C six prime one eye используйте систему промывки кювет, входящую в комплект прибора, чтобы промыть кювету для образца не менее чем 50 milliliters промывочного буфера. Удалите остатки буфера из кюветы для образца путем аспирации с помощью стеклянного шприца объемом 2.5 milliliter с длинной иглой. Удалите растворы из вакуумного дегазатора, используя вторую чистую сухую длинную иглу.

Шприц объемом 2,5 миллилитров. Осторожно наберите в шприц не менее 1,8 миллилитров образца белка A a C six prime one eye. Будьте внимательны, чтобы избежать появления пузырьков воздуха.

После того как шприц будет заполнен образцом белка, введите иглу в кювету и осторожно коснитесь ее дна. Приподнимите иглу примерно на один миллиметр и медленно введите образец в кювету до появления излишков жидкости над ее верхним краем. Чтобы удалить из кюветы попавшие внутрь пузырьки воздуха, приподнимите иглу примерно на один сантиметр, следя за тем, чтобы в переливе оставался раствор, затем быстро втяните и снова введите примерно 0.25 milliliters раствора.

Теперь осторожно переместите иглу вверх вдоль стенки перелива. В лунке для образца игла упрется в выступ. Отоберите всю жидкость выше этого уровня, так как выступ указывает на необходимую высоту рабочего раствора.

Для заполнения инъекционного шприца прикрепите пластиковую трубку шприца-наполнителя к порту заполнения и опустите кончик поршня до верхнего края порта. Теперь поместите капилляр с раствором лиганда DGAs в нижнюю часть держателя пипеток. Убедитесь, что кончик шприца не касается дна трубки-наполнителя, и медленно втягивайте раствор в шприц до тех пор, пока небольшое количество жидкости не поступит в трубку шприца-наполнителя.

Затем закройте загрузочный порт, опустив наконечник поршня. Для этого нажмите кнопку закрытия загрузочного порта. После этого удалите все пузырьки воздуха, которые могли образоваться в процессе загрузки.

Выполните продувку и заполнение, нажав кнопку продувки и заполнения (purge refill). Повторите процедуру продувки и заполнения в общей сложности три раза. По завершении процесса продувки и заполнения извлеките трубку для заполнения из держателя пипетки и осторожно протрите кончик шприца лабораторной салфеткой.

Теперь опустите шприц блока пипетки в образец. Действуйте осторожно и медленно, так как игла может легко погнуться. Убедитесь, что шприц вставлен полностью, нажав на основание стопорного кольца.

После закрепления шприца установите требуемую рабочую температуру и выберите опорную мощность, которая должна быть немного выше максимально ожидаемого теплового потока при инъекции. В данном примере в качестве рабочей температуры и опорной мощности используются 20 °C и 20 мкал/с соответственно. Затем запрограммируйте необходимые объемы инъекций и интервалы задержки.

В данном случае используется 28 инъекций, при этом объем первой составляет 2 µL с задержкой 62 ед., а последующих инъекций — 10 µL с задержкой 332 ед. Описанный здесь эксперимент служит основой для создания набора данных при одной концентрации для построения необходимых дополнительных кривых. Повторите этот процесс с постепенным снижением концентраций макромолекулы и лиганда.

Убедитесь, что все образцы макромолекул и лигандов получены из одного и того же стокового раствора, чтобы минимизировать погрешность в концентрациях. Здесь представлен необработанный график изотермической титрационной калориметрии, полученный при титровании 3,86 мМ лиганда ацетил-коэнзима А в раствор микромолекулы A A C six prime one с концентрацией 192 мкМ.

Для определения параметров связывания с использованием двухсайтовой последовательной аппроксимации использовались интегральные значения сигнала. На данном графике представлены изотермы, полученные методом ITC для различных концентраций ACE Coenzyme A и AAC C six Prime One Eye. Экспериментальные данные, обозначенные незакрашенными кружками, были аппроксимированы как моделью с двумя наборами независимых центров связывания, так и двухсайтовой последовательной моделью.

Более хорошее соответствие наблюдается при использовании модели с двумя последовательными центрами связывания. Используемые концентрации белка определены в сопроводительном тексте. При выполнении данной процедуры крайне важно точно соблюдать пропорции разведения, так как изменение концентраций может оказать резкое влияние на ваши результаты.